骨組織細(xì)胞低氧反應(yīng)通路與激素性股骨頭壞死.pdf

1、目的：建立激素性股骨頭無(wú)菌壞死的小鼠模型并對(duì)其進(jìn)行組織學(xué)觀察。通過(guò)模型動(dòng)物的成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)，觀察糖皮質(zhì)激素對(duì)這兩種細(xì)胞增殖分化的影響以及低氧誘導(dǎo)因子HIF一1α所起到的作用以及其對(duì)凋亡相關(guān)的Bax和BcI-2的影響。利用HIF一1α條件性敲除小鼠進(jìn)一步明確糖皮質(zhì)激素應(yīng)用時(shí)對(duì)HIF—lα的調(diào)節(jié)作用。 方法：選用2月齡的FVB小鼠，甲基強(qiáng)的松龍2lmg／kg／d皮下注射，設(shè)對(duì)照組以及激素注射1周、2周、3周、4周各組，

2、在動(dòng)物處死前10天和3天以30mg／kg的劑量腹腔注射鹽酸四環(huán)素，在激素注射完畢后1周處死，進(jìn)行蘇木精和伊紅染色、硬組織甲苯胺藍(lán)染色、趨骨性熒光素(四環(huán)素)標(biāo)記、Tunel染色和Micro—CT掃描。 取模型動(dòng)物的顱蓋骨作成骨細(xì)胞培養(yǎng)，骨髓腔沖洗作骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)。用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖。對(duì)成骨細(xì)胞行堿性磷酸酶和鈣結(jié)節(jié)染色，觀察激素對(duì)其分化成熟的影響。對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞行堿性磷酸酶和油紅染色，觀察激素對(duì)其成骨和成脂分化的影響。R

3、T—PCR檢測(cè)HIF—lα、HIF—lβ、VEGF、p53、Bax和BcI-2的基因表達(dá)，免疫組化檢測(cè)股骨頭標(biāo)本中上述蛋白的表達(dá)，并利用ReaI-time PCR定量分析HIF一1α、Bax和BcI-2的基因表達(dá)。 將HIP-1α條件性敲除小鼠和野生型小鼠依同法進(jìn)行造模。蘇木精和伊紅染色觀察形態(tài)學(xué)變化。Micro-CT進(jìn)行影像學(xué)和骨計(jì)量學(xué)分析。 結(jié)果：激素應(yīng)用4周后，小鼠軟骨下骨板和骨小梁出現(xiàn)壞死，在光鏡下證實(shí)有空的骨

4、陷窩。原先完整的骨骺被突破，有跨越骨骺的骨橋形成。正常的、粗大的骨小梁被菲薄的、成角的、不規(guī)則彎曲的小梁所取代，部分骨小梁可見(jiàn)雙熒光標(biāo)記帶形成。Tunel染色可見(jiàn)大量凋亡的骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，在關(guān)節(jié)軟骨表面可見(jiàn)凋亡的軟骨細(xì)胞。Micro-CT掃描激素注射后1～3周股骨頭和干骺端松質(zhì)骨骨量逐步下降，在激素注射后4周，發(fā)現(xiàn)有骨小梁穿過(guò)骨骺線。三維重建時(shí)，對(duì)照組的股骨頭外形較為平滑，而在激素注射后的股骨頭表面呈現(xiàn)桔皮樣改變。 MTT生長(zhǎng)

5、曲線發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素對(duì)成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖有抑制作用。 在成骨細(xì)胞中堿性磷酸酶有高表達(dá)，隨著激素劑量的增加，最主要的變化就是成骨細(xì)胞數(shù)量的減少，導(dǎo)致鈣結(jié)節(jié)數(shù)量的減少。在激素注射1、2、3周后，HIF-1α的mRNA可以突然下降，而在激素注射4周后，HIF-1α mRNA的表達(dá)上升，但總體低于對(duì)照組的HIF-1α mRNA的表達(dá)。Bax／Bcl-2的比值也呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)。 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中堿性磷酸酶和油紅染色

6、均為陽(yáng)性，提示激素應(yīng)用可使其向成骨和成脂雙向分化。HIF-1α mRNA的表達(dá)以及Bax／Bcl-2的比值與成骨細(xì)胞的的變化趨勢(shì)一致。 HIF-1 α條件性敲除小鼠和野生型小鼠HE染色顯示，前者8只小鼠僅2例發(fā)生股骨頭無(wú)菌壞死。后者8只均可見(jiàn)股骨頭無(wú)菌壞死征象，并且壞死程度較嚴(yán)重。Micro-CT的骨計(jì)量學(xué)顯示，野生型小鼠在激素應(yīng)用后骨密度和骨小梁厚度出現(xiàn)下降，HIF-1α條件性敲除小鼠則未見(jiàn)有下降。 結(jié)論：FVB小