人凍融多原核合子原核移植的初步研究.pdf

1、原核移植在生殖研究領域中具有巨大的應用前景。通過原核移植將不同來源的原核與胞漿重構為核-漿異質胚胎，可以為探討胚胎發(fā)育過程中核質互作機制、分析雌雄遺傳物質作用、防治母源性線粒體遺傳病等提供研究模型。大量動物實驗的成功經(jīng)驗可為人類胚胎原核移植提供參考。但由于人與動物的種系差異，能供參考的資料有限，人類原核移植胚胎模型的構建以及應用仍需要大量的基礎研究。目前受倫理道德法律、人類卵子/胚胎資源有限等限制，人原核移植研究進展緩慢。多原核合子(多

2、原核受精卵)是臨床治療中的“廢棄”胚胎，用于科學研究可以避免倫理法律約束。 目前胚胎冷凍技術己經(jīng)在人類輔助生殖領域中發(fā)揮了重要的作用。利用冷凍技術，人們可以有效地長期保存卵子、胚胎、卵巢組織等各種標本并建立細胞庫。不但可以克服時間與空間的限制，節(jié)省人力物力，還避免資源浪費，便于各項科學研究。常用的冷凍技術包括程序化慢速冷凍與玻璃化冷凍。程序化慢速冷凍在各生殖中心常規(guī)使用，但是這種方法程序繁瑣，耗時長，需要配備昂貴的降溫設備。玻璃

3、化冷凍在近年來逐漸受到人們的關注，相對于程序化慢速冷凍，具有簡單快速、經(jīng)濟、胚胎復蘇率高的優(yōu)點。自1998年Mukaida等首次成功應用玻璃化冷凍人類胚胎并移植獲得妊娠，目前己有較多不同發(fā)育階段的玻璃化冷凍胚胎妊娠成功的報道，有逐漸取代慢速冷凍的趨勢。 臨床上的多原核受精卵為原核移植基礎研究提供了理想的材料來源。但是，多原核受精卵資源同樣有限，而且提供原核與胞漿的多原核受精卵通常無法同時獲得。因此，能否將平時收集到的多原核受精卵

4、妥善保存起來以供隨時所需成為目前有待解決的問題。本研究以玻璃化冷凍方法保存多原核受精卵并對其在原核移植中的應用潛能進行初步研究?！灸康摹?通過新鮮多原核受精卵與玻璃化凍融多原核受精卵之間的原核移植，探討凍融后的原核及胞漿用于重構原核期胚胎的可行性，以及比較不同重構胚胎的發(fā)育潛能。從而為解決原核供者與胞漿供者在取卵時間上的同期配合難題提供可行途徑，充分利用臨床“廢棄”胚胎構建核．漿異質胚胎模型。 【方法】 1、在受

5、精后16-20小時，觀察胚胎的原核形成與極體排出情況，含有3個或以上原核+2個極體者記錄為多原核受精卵。經(jīng)患者簽署知情同意書后，選擇透明帶完整以及原核清晰的多原核受精卵納入實驗中。 2、實驗分組： (1)新鮮原核移植組。由新鮮多原核受精卵之間相互原核置換的重構胚胎。 (2)新鮮原核．凍融胞漿原核移植組。由新鮮原核與玻璃化凍融胞漿重構的胚胎。 (3)凍融原核．新鮮胞漿原核移植組。由玻璃化凍融原核與新鮮胞漿重

6、構的胚胎。 (4)玻璃化凍融多原核胚胎組． (5)新鮮多原核胚胎對照組。 (6)新鮮多原核胚胎去多余原核操作對照組。 3、對多原核受精卵進行玻璃化冷凍解凍、原核移植(電融合法)、去除多余原核操作。 4、對各組胚胎進行體外培養(yǎng)，觀察與記錄胚胎發(fā)育情況并進行形態(tài)學評分。 5、以熒光原位雜交技術對胚胎進行X、Y、18號染色體非整倍體分析。 6、結果進行統(tǒng)計學分析。 【結果】

7、 1、共收集152個多原核受精卵用于本研究。 2、共冷凍多原核受精卵57個，回收56個，回收率為98.25％。復蘇51個，復蘇率為90.38％。28個冷凍復蘇的多原核受精卵(V-3PN)與新鮮多原核受精卵(3PN)進行發(fā)育形態(tài)學比較，兩組的卵裂率、4-細胞率、囊胚率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，V-3PN組的6-細胞以上率低于3PN組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 3、共對68個多原核受精卵(23個凍融與45

8、個新鮮)進行原核移植操作，核-漿復合體重構成功62個，總操作成功率為91.18％。進行電融合62個，融合成功54個，平均融合成功率為87.10％。分別重構新鮮原核移植胚胎(FF-PNT)16個、新鮮原核．凍融胞漿胚胎(FT—PNT)17個、凍融原核．新鮮胞漿胚胎(TF-PNT)21個。三組問核．漿復合體重構率、電融合成功率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。對21個多原核受精卵去核操作(E-2PN)，去核存活20個，操作成功率為95.24

9、％。 4、原核移植組胚胎發(fā)育形態(tài)學比較： 在新鮮胞漿情況下(TF-PNT VS FF-PNT&E-2PN)，TF-PNT與FF-PNT的卵裂率、4-細胞率、6-細胞以上率、Day3胚胎各分級比率相近，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。TF-PNT組與E-2PN組的卵裂率、4-細胞率、6-細胞以上率、Day3胚胎各分級比率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 在新鮮原核情況下(FT-PNT VS FF-PNT&E-2

10、PN)，F(xiàn)T-PNq、組的卵裂率、4-細胞率、6-細胞以上率低于FF-PNT組，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；兩組的Day3胚胎各分級比率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。FT-PNT組的卵裂率、4-細胞率、6-細胞以上率低于E-2PN組，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；FT-PNT組6-細胞以上率低于E-2PN組，P值為0.022，差異有統(tǒng)計學意義。兩組的Day3胚胎各分級比率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 在FF-

11、PNT組、FT-PNT組、TF-PNT組與E-2PN組4組中，新鮮原核．凍融胞漿組(FT-PNT)中29.4％Day2胚胎未卵裂，未卵裂率高于其余3組，P=0.439，差異有統(tǒng)計學意義。 5、對發(fā)育停滯超過24小時的原核移植胚胎進行Hochest33342染色。大部分卵裂球內含單個細胞核，部分卵裂球無核物質，部分卵裂球含2個或以上細胞核。成功對4個新鮮原核移植胚胎(FF-PNT)、2個新鮮原核-凍融胞漿原核移植胚胎(FT-PNT

12、)、3個凍融原核．新鮮胞漿原核移植胚胎(TF-PNT)共9個胚胎進行了細胞固定與X、Y、18號染色體非整倍體分析。被分析的胚胎存在染色體數(shù)目異常，表現(xiàn)為正常嵌合型、異常嵌合型與無序分裂型。 【結論】 1.玻璃化凍融多原核受精卵可以與新鮮多原核受精卵構建核-漿異質胚胎模型。玻璃化凍融過程不影響原核移植效率。 2.以玻璃化凍融多原核受精卵為基礎的原核移植重構胚胎具有卵裂能力。采用新鮮胞漿可能更有利于原核移植重構胚胎的