2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景和目的: 神經(jīng)干細(xì)胞(Neuralstemcells,NSCs)是能分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞,能自我更新并足以提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞。因此,神經(jīng)干細(xì)胞有可能成為腦組織移植的新型供體源,能較好地解決神經(jīng)移植治療的倫理道德及供體不足等問題,可望成為解決中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能重建和神經(jīng)再生的一條新途徑。此外,也為了解和闡明神經(jīng)發(fā)育機(jī)制提供了有力的證據(jù)。 位于側(cè)腦室附近的室管膜前下區(qū)(Anteriorsubv

2、entricularzone,SVZa)是神經(jīng)干細(xì)胞較為集中的地方之一。從胚胎期至成年階段,此區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)背-腹信號控制下,不斷沿著嘴側(cè)遷移流(Rostralmigratorystream,RMS)向嗅球(Olfactorybulb,OB)遷移,最后在OB分化為中間神經(jīng)元,并成為其終身更新的來源。此區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞具有以下特點(diǎn):(1)能長距離定向遷移;(2)自產(chǎn)生起即具備發(fā)育為神經(jīng)元的潛能;(3)在遷移過程中始終維持增殖狀態(tài)和神經(jīng)元分

3、化潛能而不進(jìn)一步分化。因此,SVZa神經(jīng)干細(xì)胞成為研究神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移和分化調(diào)控機(jī)制研究的較佳模型,并成為神經(jīng)干細(xì)胞研究的重點(diǎn)。 在SVZa神經(jīng)干細(xì)胞向OB遷移、分化的過程中,需要很多內(nèi)在和外在的因素來共同控制。研究表明,Dlx(distall-lesshomeobox)基因家族中的Dx5基因與OB中間神經(jīng)元的發(fā)育密切相關(guān)。因?yàn)榛蚯贸蟮膶?shí)驗(yàn)表明:Dlx5基因在OB中間神經(jīng)元分化和OB受體神經(jīng)元軸突連接中起著主要作用;是O

4、BSVZ祖細(xì)胞成熟為分離后的局部環(huán)路(中間)神經(jīng)元所必須的;而且只對嗅系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)的神經(jīng)干細(xì)胞的分化進(jìn)行調(diào)節(jié),是出生后神經(jīng)發(fā)生必須的基因。因此推測,Dlx5基因在SVZa神經(jīng)干細(xì)胞向OB定向遷移及分化的過程中起著重要的作用,但上述研究對Dlx5基因的作用及其機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明。本研究以SVZa神經(jīng)干細(xì)胞的遷移、分化模型為基礎(chǔ),以體外培養(yǎng)的新生大鼠SVZa神經(jīng)干細(xì)胞為研究對象,通過基因轉(zhuǎn)染等方法研究Dlx5基因在SVZa神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律

5、及其對神經(jīng)元分化的影響,這方面的研究鮮見報(bào)道。 方法: 1.運(yùn)用DNA重組技術(shù),將小鼠Dx5基因(mDx5)從原核表達(dá)質(zhì)粒上用內(nèi)切酶消化下來,插入到EGFP質(zhì)粒C-末端的多克隆位點(diǎn)中,構(gòu)建一個(gè)可以用于真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的Dx5重組質(zhì)粒,并通過雙酶切及DNA測序來鑒定。 2.通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測Dlx5、Er81、Islet1蛋白在生后0天及7天大鼠SVZa、RMS和OB中的表達(dá)情況,以了解SVZa細(xì)胞的分子生物

6、學(xué)特性和表型,以及它們與神經(jīng)干細(xì)胞遷移分化的關(guān)系。 3.運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對SVZa神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行分離、增殖、傳代培養(yǎng),用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法對其干細(xì)胞特性及分化潛能進(jìn)行鑒定;還用Dlx5、Er81、Islet1抗體聯(lián)合檢其蛋白在SVZa及紋狀體來源的神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá)情況,以比較不同部位來源的神經(jīng)干細(xì)胞中這些分子特性及表型的異同。 4.通過基因轉(zhuǎn)染、RT-PCR、WesternBlot等方法研究重組質(zhì)粒在SVZa神經(jīng)干細(xì)

7、胞中的表達(dá)情況; 5.運(yùn)用活體熒光標(biāo)記,詳細(xì)研究基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞分化后的形態(tài)特征,并用免疫熒光雙標(biāo)確定分化細(xì)胞的類型,以了解Dlx5基因轉(zhuǎn)染與神經(jīng)元分化的關(guān)系。 6.提取每一代SVZa神經(jīng)干細(xì)胞的總RNA,用RT-PCR檢測其內(nèi)源性Dlx5mRNA的表達(dá)情況,并用不表達(dá)內(nèi)源性Dlx5mRNA的細(xì)胞進(jìn)一步研究:用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該代神經(jīng)干細(xì)胞,了解外源轉(zhuǎn)染基因mRNA的表達(dá)情況,同時(shí)了解其內(nèi)源性Dlx5mRNA的變化情況;用BMP

8、-2處理該代神經(jīng)干細(xì)胞24小時(shí)后,用同樣的方法了解內(nèi)源性Dlx5mRNA的變化情況。 7.最后,分別將傳代后,還表達(dá)內(nèi)源性Dlx5mRNA代次的神經(jīng)干細(xì)胞;繼續(xù)傳代后不再表達(dá)內(nèi)源性Dlx5mRNA的神經(jīng)干細(xì)胞;基因轉(zhuǎn)染已不再表達(dá)內(nèi)源性Dlx5mRNA的該代神經(jīng)干細(xì)胞;BMP-2處理已不再表達(dá)內(nèi)源性Dlx5mRNA的該代神經(jīng)干細(xì)胞分化后,用流式細(xì)胞儀檢測它們的神經(jīng)元分化比例。 結(jié)果: 1.新構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pE

9、GFP-mDlx5,經(jīng)過雙酶切后分別產(chǎn)生了一個(gè)780bp的mDx5基因插入片段及4680bp的EGFP載體片段,大小與預(yù)期結(jié)果相符;測序后,將序列在GeneBank中用Blast軟件進(jìn)行同源性比對,結(jié)果,780bp插入片段與已知小鼠Dlx5基因的同源性為100%,而且開放閱讀框沒有移位; 2.Dlx5、Er81蛋白主要定位于細(xì)胞核,胞漿內(nèi)也存在。Er81蛋白分布比較廣泛,在新生大鼠很多腦區(qū)都有表達(dá),包括OB、RMS、SVZa、紋

10、狀體、海馬、大腦皮層下等;除紋狀體外,Dlx5蛋白也在上述腦區(qū)中表達(dá);Dlx5及Er81蛋白在生后0天及7天大鼠SVZa、RMS、OB中表達(dá)都比較強(qiáng),而且,分布的區(qū)域相似,呈重疊表達(dá)的方式,在OB主要分布于顆粒細(xì)胞層和球周細(xì)胞層。Islet1蛋白不在SVZa、RMS、OB中表達(dá),主要存在于紋狀體,在大腦皮層下也能檢測到。 3.體外培養(yǎng)的SVZa來源的神經(jīng)球細(xì)胞通過鑒定,干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin陽性,而且能分化成神經(jīng)系統(tǒng)三種譜系的

11、細(xì)胞,還具有Dlx5、Er81蛋白陽性,Islet1蛋白陰性的分子生物學(xué)特性和表型,而紋狀體來源的神經(jīng)球細(xì)胞則是Er81、Islet1蛋白陽性,Dlx5蛋白陰性的。 4.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SVZa神經(jīng)干細(xì)胞后,4小時(shí)開始出現(xiàn)綠色熒光,8小時(shí)后增多明顯,24到48小時(shí)達(dá)高峰,并持續(xù)較長時(shí)間。24小時(shí)后RT-PCR檢測到外源轉(zhuǎn)染基因的mRNA表達(dá),WesternBlot檢測到58KD目的蛋白表達(dá)。表明pEGFP-mDlx5能在SVZa神經(jīng)

12、干細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá),是一個(gè)有用的工具; 5.通過活體熒光標(biāo)記發(fā)現(xiàn),基因轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞都分化成了有突起的細(xì)胞,其形態(tài)特點(diǎn)主要有兩種:只有兩條突起,分別向相反方向伸長,形成兩個(gè)極;有一很長的、分支較少的突起,類似軸突,而其他突起短、細(xì),有分支。經(jīng)過NSE雙標(biāo)證實(shí),這些細(xì)胞為神經(jīng)元樣細(xì)胞。 6.常規(guī)傳代培養(yǎng)下,SVZa神經(jīng)干細(xì)胞中內(nèi)源性Dlx5基因mRNA表達(dá)具有一定的規(guī)律性:在第1至第3代時(shí),RT-PCR能檢測到內(nèi)源性Dlx5

13、mRNA表達(dá),繼續(xù)傳代至第4代時(shí),表達(dá)消失;不過,這種改變是可逆的,用Dlx5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染第4代細(xì)胞后24小時(shí),不但外源轉(zhuǎn)染基因mRNA有表達(dá),內(nèi)源性Dlx5基因mRNA也恢復(fù)了表達(dá);用100ng/ml的BMP-2處理第4代細(xì)胞后24小時(shí),內(nèi)源性Dlx5基因也能重新出現(xiàn)。 7.相應(yīng)地,上述四種Dlx5mRNA表達(dá)狀態(tài)的神經(jīng)干細(xì)胞分化后,用FCM檢測到的神經(jīng)元比例分別為:19.16±0.75%;8.34±0.36%;35.66±0

14、.58%;22.27±0.12%。單因素方差分析表明:各組間兩兩比較,神經(jīng)元分化比例均有顯著差異,P<0.05。 結(jié)論: 1.聯(lián)合檢測SVZa神經(jīng)干細(xì)胞中Dlx5、Er81、Islet1蛋白表達(dá)能區(qū)別其它部位如紋狀體來源的神經(jīng)干細(xì)胞,Dlx5、Er81蛋白表達(dá)陽性,Islet1蛋白陰性是SVZa神經(jīng)干細(xì)胞的分子特性和表型之一; 2.常規(guī)體外培養(yǎng)的SVZa神經(jīng)干細(xì)胞中,內(nèi)源性Dlx5基因mRNA表達(dá)具有一定的規(guī)律性

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