神經(jīng)干細胞誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元過程中Mash1及Hes1基因的表達.pdf

1、研究背景：神經(jīng)干細胞是一類可以自我更新、增殖的多潛能細胞，并在一定的條件下能夠分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。它的這一特性，使它可以代替損傷、丟失或死亡的神經(jīng)元[1]，打破了中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟后不可再生的理論。神經(jīng)干細胞具有神經(jīng)營養(yǎng)、支持和保護作用，同時能夠定向誘導(dǎo)分化為特定的神經(jīng)元，因此神經(jīng)干細胞移植療法為神經(jīng)退行性疾?。ㄈ纾号两鹕。┑闹委熖峁┝诵碌乃悸穂2-4]。但是神經(jīng)干細胞的臨床應(yīng)用仍存在諸多問題[5]，例如神經(jīng)干

2、細胞移植到病變區(qū)域后，分化出的所需要的特異性神經(jīng)元（如：多巴胺能神經(jīng)元）是否足夠，以達到預(yù)期的治療效果等。神經(jīng)干細胞體外分化至多巴胺能神經(jīng)元是一個十分復(fù)雜的過程，其誘導(dǎo)條件與分化機制目前尚未清楚。
　　在哺乳類動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在著多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，它們對于維持神經(jīng)元的存活、生長、發(fā)育及功能成熟等具有重要的作用[6-8]。膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glialcellline-derivedneurotrophicfactor,

3、GDNF）最初被認為對多巴胺能神經(jīng)元具有特異性營養(yǎng)活性和保護作用，而最新研究認為，它有促進神經(jīng)干細胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的作用，且當濃度為10μg/L效果最好[9-10]。Ling和Carvey等[11-12]研究表明，白細胞介素1α（Interleukin-1α,IL-1α）在0.1μg/L的濃度下能誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞向多巴胺能神經(jīng)元分化。目前尚未見這兩種因子聯(lián)合誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞分化為多巴胺能神經(jīng)元的報道。
　　神經(jīng)干細胞的增殖、分化

4、是一個十分復(fù)雜的過程，其中堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子（basichelix-loop-helix，bHLH）在其中起著重要作用[13-14]，bHLH轉(zhuǎn)錄因子分為抑制型基因：Hes1(Hairyandenhancerofsplit1)等；激活型基因：Mash1（Mammalianachaete-scutehomlog1）等，兩者處于動態(tài)平衡互相調(diào)控，在神經(jīng)干細胞增殖和分化的調(diào)控等各方面中發(fā)揮重要作用[15-16]。Mash1基因表達于早

5、期發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)中，有促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化的作用[17-18]。Hes1基因則是在維持神經(jīng)干細胞自我更新能力和抑制多潛能神經(jīng)前體細胞向神經(jīng)元分化和建立正常的神經(jīng)元功能中起關(guān)鍵性的作用。
　　目的：本實驗分為兩部分，第一部分旨在通過神經(jīng)干細胞的體外培養(yǎng)及向多巴胺能神經(jīng)元誘導(dǎo)分化，觀察其生物學(xué)特性，了解獲取高比例分化為多巴胺能神經(jīng)元的條件；第二部分通過進一步研究神經(jīng)干細胞分化為多巴胺能神經(jīng)元過程中bHLH轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因Mash

6、1和Hes1的表達變化，為神經(jīng)干細胞向多巴胺能神經(jīng)元分化過程的機制研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：第一部分：無菌條件下取孕14-16天的胚胎大鼠端腦，制備成單細胞懸液，接種至增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成神經(jīng)球后傳代。取第三，第四代神經(jīng)干細胞進行巢蛋白（Nestin）免疫熒光檢測及分化能力鑒定，并將第三，第四代神經(jīng)球接種至預(yù)先用多聚賴氨酸包被的24孔板中，分為對照組（空白對照組）、實驗組1（GDNF組）與實驗組2（GDNF+IL-1α聯(lián)合誘導(dǎo)組

7、）進行誘導(dǎo)分化，在含5％CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2周，用免疫熒光法檢測β-tubulinⅢ和酪氨酸羥化酶（tyrosinehydroxylase,TH）的表達。
　　第二部分：取體外培養(yǎng)的第三，第四代神經(jīng)球，作實時熒光定量PCR檢測第三，第四代神經(jīng)干細胞之間Mash1與Hes1基因表達是否有差異；再將第四代神經(jīng)球接種于預(yù)先用多聚賴氨酸包被的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，分為對照組（空白對照組）與實驗組（GDNF+IL-1α聯(lián)合誘導(dǎo)組）進行誘

8、導(dǎo)分化，在含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2天半量換液1次，取分化第1周和第2周的細胞，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)分析其分化過程中Mash1與Hes1基因的表達變化。
　　結(jié)果：第一部分：神經(jīng)干細胞的體外培養(yǎng)獲得了大量能自我增殖的神經(jīng)干細胞，細胞傳代培養(yǎng)至第三，第四代后，免疫熒光檢測Nestin表達細胞陽性率為第三代93.35±3.36%，第四代93.04±3.55%，兩者間比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異。誘導(dǎo)分化2周后免疫熒光檢測各組β

9、-tubulinⅢ細胞陽性率分別為：第三代，對照組（11.41±1.42%）、實驗組1（22.40±1.43%）、實驗組2（34.01±3.94%），各組間比較存在統(tǒng)計學(xué)差異；第四代，對照組（12.65±1.58%）、實驗組1（23.55±2.03%）、實驗組2（33.95±2.97%），各組間比較存在統(tǒng)計學(xué)差異；第三，第四代神經(jīng)干細胞分化間比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異。TH細胞陽性率分別為：第三代，對照組（1.04±0.26%）、實驗組1（4.

10、56±0.77%）、實驗組2（6,08±1.39%），各組間比較存在統(tǒng)計學(xué)差異；第四代，對照組（1.46±0.41%）、實驗組1（7.99±1.15）、實驗組2（15.51±1.94%），各組間比較存在統(tǒng)計學(xué)差異；第三，第四代神經(jīng)干細胞分化間比較存在統(tǒng)計學(xué)差異。
　　第二部分：Mash1和Hes1基因在神經(jīng)干細胞分化前后均有表達。第三，第四代神經(jīng)干細胞間比較顯示，第四代神經(jīng)干細胞的Mash1基因表達明顯高于第三代神經(jīng)干細胞，兩者間

11、比較存在統(tǒng)計學(xué)差異；而第四代神經(jīng)干細胞的Hes1基因則明顯低于第三代神經(jīng)干細胞，兩者間比較存在統(tǒng)計學(xué)差異。第四代神經(jīng)干細胞誘導(dǎo)分化后，Mash1基因于分化后表達升高，實驗組與對照組比較存在統(tǒng)計學(xué)差異，分化2周與分化1周比較存在統(tǒng)計學(xué)差異；Hes1基因則于分化后表達降低，實驗組與對照組間比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異，分化2周與分化1周比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論：1、GDNF和IL-1α聯(lián)合作用能夠誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞較高比例的分化為多巴胺能神經(jīng)