Hes1和Mash1基因在脊髓源神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元過程中表達(dá)的研究.pdf

1、第一部分，研究背景：神經(jīng)干細(xì)胞作為一種具有自我更新、增殖和可以定向分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞能力的細(xì)胞，不僅打破了中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟后不可再生的理論，還為神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)和退行性病變的治療提供了新的思路。對于神經(jīng)干細(xì)胞的研究，是以保持體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞具有活躍的增殖能力為基礎(chǔ)的。同時，中樞神經(jīng)系統(tǒng)各種不同的疾病大多是由于表型和功能不同的神經(jīng)元病變所致，然而許多研究表明如果將神經(jīng)干細(xì)胞直接移植于受損區(qū)，則分化成所需的特異

2、性神經(jīng)元將很少，難以發(fā)揮功能效應(yīng)。神經(jīng)干細(xì)胞的分化是一個復(fù)雜的多因素參與的過程，對于膽堿能神經(jīng)元的體外分化條件和機(jī)制的研究目前尚未達(dá)成共識。 目的：本部分的研究旨在通過對神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)，觀察研究其基本生物學(xué)特性，了解其增殖分化和體外培養(yǎng)獲得大量擴(kuò)增的條件，為進(jìn)一步研究神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化奠定基礎(chǔ)。在體外環(huán)境下誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元分化，探討神經(jīng)干細(xì)胞的體外分化條件及誘導(dǎo)分化機(jī)制。 方法：將孕齡17d的胚胎大鼠

3、脊髓組織制備成單細(xì)胞懸液，接種到限定性無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待形成原代克隆球后傳代擴(kuò)增。對第3代的神經(jīng)干細(xì)胞球進(jìn)行神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白(Nestin)免疫熒光檢測。然后，將神經(jīng)干細(xì)胞克隆球接種到內(nèi)置多聚賴氨酸包被的蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，應(yīng)用誘導(dǎo)因子RA、SHH、NT-3和BDNF對神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化。在37℃、5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中分化兩周后，用免疫熒光檢測膽堿能神經(jīng)元特異性標(biāo)志物膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的表達(dá)。 結(jié)果：

4、獲得了大量能自我增殖，表達(dá)Nestin，并可在體外長期維持穩(wěn)定狀態(tài)的神經(jīng)干細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)1 w后，可見分化的細(xì)胞呈典型的神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)：胞體飽滿而不規(guī)則，有多個細(xì)長突起；誘導(dǎo)2 w后，神經(jīng)細(xì)胞之間形成了網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，免疫熒光檢測，ChAT陽性率達(dá)20％。 結(jié)論：從大鼠胚胎脊髓組織中分離得到的細(xì)胞具有不斷增殖和自我更新能力，并具有分化為神經(jīng)元的潛能。SHH、 RA、NT-3和BDNF的共誘導(dǎo)可以誘導(dǎo)脊髓源性神經(jīng)干細(xì)

5、胞在體外分化為膽堿能神經(jīng)元。 第二部分，研究背景：神經(jīng)干細(xì)胞的生長和發(fā)育過程的調(diào)控涉及多個方面，包括神經(jīng)細(xì)胞特性的決定、細(xì)胞數(shù)量的控制，細(xì)胞分化的格局化和空間控制等。眾多基因家族參與了該過程，其中bHLH家族的Hes1和Mash1基因，作為神經(jīng)發(fā)育的相關(guān)基因，廣泛表達(dá)于發(fā)育中的中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)。Hes基因?qū)儆谪?fù)調(diào)控型的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，在維持神經(jīng)干細(xì)胞增殖，使大腦細(xì)胞具有正確的數(shù)目、形態(tài)和細(xì)胞排列等方面具有重要的作用。正調(diào)控型

6、轉(zhuǎn)錄因子Mash1基因，則有促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元分化作用。正調(diào)控型和負(fù)調(diào)控型bHLH轉(zhuǎn)錄因子之間的彼此調(diào)控，共同調(diào)控著神經(jīng)干細(xì)胞的分化并且決定著其分化方向。本實(shí)驗(yàn)通過體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元分化，觀察Hes1和Mash1基因的表達(dá)變化，了解它們在神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為膽堿能神經(jīng)元過程中發(fā)揮的作用。 目的：通過檢測胚胎大鼠脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元過程中Hes1和Mash1基因的表達(dá)變化，探討神經(jīng)干細(xì)胞

7、的定向分化機(jī)制。 方法：取體外培養(yǎng)的第三代的神經(jīng)干細(xì)胞，接種于多聚賴氨酸包被過的6孔培養(yǎng)板中，通過在培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)因子RA、SHH、NT-3和BDNF，誘導(dǎo)其向膽堿能神經(jīng)元分化。應(yīng)用實(shí)時定量PCR技術(shù)分析神經(jīng)干細(xì)胞及向膽堿能神經(jīng)元誘導(dǎo)分化1 w和2 w時，Hes1、Mash1和Nestin基因的表達(dá)變化。 結(jié)果：Hes1、Mash1和Nestin mRNA在神經(jīng)干細(xì)胞分化前后表達(dá)有變化，誘導(dǎo)1w時各基因均較對照組表達(dá)下