P物質在脊髓損傷后骨質疏松發(fā)病中的作用機制.pdf

1、骨質疏松是脊髓損傷的常見并發(fā)癥之一，其發(fā)病機理尚不清楚。神經系統(tǒng)對骨的調節(jié)作用是近年來研究的重要進展之一，研究表明神經因素在骨重建過程中可能起到十分關鍵的作用。 本課題首次探討SP在脊髓損傷后骨質疏松中的作用機制，并比較與廢用性骨質疏松的差別。從組織、細胞和分子水平上探討SP免疫陽性神經纖維及其受體的分布、SP對脊髓損傷后MSCs源性成骨細胞的影響，對骨重建相關基因及蛋白表達的影響等。 第一部分：脊髓損傷和后肢制動對生長

2、期大鼠脊髓損傷平面上下骨組織的骨量、骨結構、骨生物力學和骨代謝影響的比較研究 脊髓損傷患者下肢和骨盆的骨量丟失速度較快，很容易導致骨質疏松癥的發(fā)生。但是目前關于脊髓損傷后骨質疏松的發(fā)病機制和治療的研究仍較少，特別是對脊髓損傷后骨質疏松的發(fā)病機制認識不深。脊髓損傷與臥床和失重相比能引起更嚴重的骨量丟失，活動的喪失在骨質疏松發(fā)病過程中可能起到重要作用。除此以外，神經損傷和代謝的改變也可能參與脊髓損傷后骨量的丟失。 目的：

3、 本研究的目的是觀察脊髓損傷和后肢制動對雄性大鼠脊髓損傷平面上下骨組織的影響。比較骨量、骨結構、骨生物力學和骨代謝等指標的差異，從而推測脊髓損傷后導致骨質疏松的可能原因。 材料與方法： 40只6周齡雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為四組：基線對照組，年齡匹配對照組，后肢制動組，脊髓損傷組。在術后第4周分別取尿液、血清和骨組織標本。左側腓腸肌立即稱重；左側肱骨、脛骨測量長度、濕重、體積。接下來用雙能X線法測量

4、左肱骨、脛骨骨礦含量和骨密度；然后進行生物力學測試；之后測量干重和灰重。右側肱骨、脛骨首先進行Micro-CT掃描；然后進行動態(tài)的骨組織形態(tài)學檢測。用EIA方法分別測量血清和尿液中骨鈣素和脫氧吡啶諾林的含量。 結果： 脊髓損傷和后肢制動均能引起生長期大鼠后肢成熟相關性骨量增加的減少，并且兩者導致的骨丟失有明顯的差異。脊髓損傷組脛骨的干重和灰重較后肢制動組有明顯的下降，分別減少了7.5％和8.2％。 結論：

5、 雖然脊髓損傷和后肢制動均能引起大鼠脛骨的骨量丟失、骨結構退變和骨強度的降低，但是兩種損傷對骨代謝的影響是不同的。脊髓損傷導致更為嚴重的骨量丟失、骨小梁微結構和骨皮質的幾何結構的破壞、骨力學性能的下降。同時，脊髓損傷引起骨代謝處于高轉換狀態(tài)。通過以上結論我們推測神經損傷因素是導致脊髓損傷后骨質疏松的一個主要原因。 第二部分：脊髓損傷和后肢制動對脊髓損傷平面上下骨組織中P物質免疫陽性神經纖維分布影響的比較研究 雖然脊髓損傷

6、和后肢制動都會導致骨量丟失，但是這兩種損傷對骨重建的作用有一定的差異。本論文的第一部分已經證明了兩組動物模型在脊髓損傷平面以下脛骨的骨量、骨結構、骨生物力學、骨代謝的差異，從而推測神經因素在脊髓損傷后骨質疏松發(fā)病中起到了重要作用。 目的： 本研究的目的是觀察脊髓損傷和后肢制動在不同時間段內對脊髓損傷平面上下骨組織的影響。比較骨密度、骨組織形態(tài)學、SP免疫陽性神經纖維的分布、骨組織微環(huán)境中SP含量的變化。從而推測SP在脊髓

7、損傷后骨質疏松發(fā)病中起重要作用。 材料與方法： 108只6周齡Sprague-Dawley雄性大鼠隨機分為9組(n=12/組)，以1、3、6周作為本實驗研究的時間點。分組情況如下：脊髓損傷1周組、脊髓損傷3周組、脊髓損傷6周組、后肢制動1周組、后肢制動3周組、后肢制動6周組、對照1周組、對照3周組、對照6周組。 結果： 免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)脊髓損傷1周、3周和6周右脛骨近端SP免疫陽性神經纖維的染色均高于相應

8、的后肢制動組和對照組。而右肱骨近端SP的染色在三個時間點的各組間無差異。 結論： 脊髓損傷與后肢制動相比能引起更嚴重的骨量丟失、骨結構退變。這種改變伴隨著損傷早期SP免疫陽性神經纖維分布的增加和SP在骨組織微環(huán)境中含量的增加。 第三部分：P物質對脊髓損傷后大鼠骨髓間充質干細胞源性成骨細胞生物學行為的影響 許多研究表明SP增強了破骨細胞的骨吸收作用，但對成骨細胞的研究較少。并且，SP對脊髓損傷后大鼠骨髓MS

9、Cs源性成骨細胞的影響至今未見報導。 目的： 本研究主要目的是研究脊髓損傷后大鼠骨髓MSCs源性成骨細胞內NK1受體的分布。觀察不同濃度、不同時間SP對成骨細胞的增殖、分化、礦化的影響。并用SP非特異性的阻滯劑和NK1受體特異性的阻滯劑進行干預，從而推測其作用細胞的靶受體。本研究探討SP對成骨細胞生物學行為的影響，揭示其在脊髓損傷后骨質疏松發(fā)病中的作用機制。 材料與方法： 10只雄性6周齡SD大鼠制作SC

10、I模型。取SCI三周大鼠的雙側脛骨、股骨，用DMEM完全培養(yǎng)液沖洗髓腔后收集細胞懸液。首先進行骨髓MSCs源性成骨細胞的誘導培養(yǎng)，用第二代細胞進行實驗。用免疫細胞化學的方法檢測MSCs源性成骨細胞內是否有NK1受體的表達。 結果： 脊髓損傷后大鼠骨髓MSCs源性成骨細胞膜及胞漿內存在NK1受體的分布，胞漿內含量較多。與對照組比較不同濃度的SP對細胞的增殖有不同程度的促進作用，10-8M濃度的促進作用最強(+124.5％，

11、P＜0.01)，且增殖具有時間依賴性，隨時間延長增殖越旺盛(96h：+121.8％，P＜0.01)。細胞的增殖可以被Spantide和L703606所抑制，與SP組比較兩者分別抑制了48.3％和45.4％。 結論： 脊髓損傷后導致的骨質疏松，除了廢用這種機械性因素以外，神經損傷所誘發(fā)的骨組織微環(huán)境中SP的增多有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)NK1受體存在于骨髓MSCs源性成骨細胞中，NK1受體是SP作用的靶受體，SP通過NK1受體

12、對成骨細胞的生物學行為產生影響。本研究還發(fā)現(xiàn)盡管SP促進了成骨細胞的增殖，但SP抑制了成骨細胞的分化和礦化，使成熟的成骨細胞減少，從而引起骨質疏松的發(fā)生。 第四部分：P物質對骨髓間充質干細胞源性成骨細胞和骨組織微環(huán)境中RANKL/OPG表達的影響 近年來，對骨質疏松發(fā)病機理的研究逐漸集中在破骨細胞分化的信號傳導上。其中核因子受體激活物(RANK)及其配體(RANKL)和骨保護蛋白(OPG)組成的細胞因子系統(tǒng)是最重要的途徑

13、。成骨細胞可以分泌RAHKL，RANK存在于單核-巨噬細胞、破骨細胞表面。RANKL與單核-巨噬細胞表面的RANK結合，促進單核-巨噬細胞向破骨細胞分化，骨吸收增強。OPG是由骨髓基質細胞/成骨細胞分泌的RANKL的“假目標”受體，可以與RANKL競爭結合，阻斷RANKL與RANK結合，從而抑制破骨細胞的分化和功能。在骨重建過程中，成骨細胞與破骨細胞在局部細胞因子的作用下，互相聯(lián)系，互相制約。 目的： 本研究目的是探討S

14、P對脊髓損傷后大鼠骨髓MSCs源性成骨細胞及骨組織微環(huán)境中RANKL/OPG表達的影響，從而揭示SP在骨代謝中的作用。 材料與方法： 20只雄性6周SD大鼠，分為SCⅠ組和SHAM。飼養(yǎng)3周后采用腹主動脈放血法處死大鼠。收集右側脛骨，剔除周圍軟組織后測定其骨密度。左側的脛骨切取后立刻液氮冷凍保存，一部分用于骨組織提取RNA，半定量RT-PCR分析RANKL、OPG、Collal、OCN基因的表達變化；另一部分用于EIA方

15、法測量骨組織中RANKL和OPG的含量。取SCⅠ組雙側股骨，用DMEM完全培養(yǎng)液(GIBCO)沖洗髓腔后收集細胞懸液。骨髓MSCs源性成骨細胞培養(yǎng)至第二代，用10-8MSP進行作用，對照組不加處理因素。用免疫細胞化學的方法進行RANKL和OPG的染色，免疫組化染色定量分析表達量的變化；用半定量RT-PCR分析RAHKL、OPG、Collal、OCN基因的表達變化；用EIA方法檢測細胞培養(yǎng)基中RANKL和OPG蛋白的表達變化。 結

16、果： 3周時SCⅠ組脛骨的骨密度明顯低于SHAM組，骨密度的下降既發(fā)生在脛骨近端干骺端(-26.3％，P＜0.05)，又發(fā)生在脛骨干(-21.2％，P＜0.05)。通過免疫細胞化學的方法進行定量分析顯示，SP處理后比不加處理因素的MSCs源性成骨細胞表達RANKL顯著增加(P＜0.05)。用RT-PCR的方法檢測，SCI后3周大鼠脛骨近端骨組織微環(huán)境中RANKL的表達顯著上調(+122.2％，P＜0.01)，OPG的表達顯著下調

17、(-22.1％，P＜0.05)，OCN的表達顯著下調(-25.3％，P＜0.05)。SP作用72h后MSCs源性成骨細胞RANKL的表達顯著上調(+160.2％，P＜0.01)，OPG的表達顯著下調(-45.5％，P＜0.01)，OCN的表達顯著下降(-42.9％，P＜0.01)。RANKL和OPG的表達也得到了EIA的證實。 結論： SP在成骨細胞與破骨細胞偶聯(lián)的關系中發(fā)揮重要作用。它既可以對成骨細胞產生直接作用(抑制