Bmi-1在抗骨質(zhì)疏松中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、Bmi-1基因?qū)儆赑olyeomb基因家族成員，由于它具有阻抑子的功能，能抑制細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶抑制因子(CDKI)p16ink4a槲和p19arf，并與多種實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，因此被認(rèn)為是原癌基因。然而，敲除小鼠Bmi-1基因引起小鼠出生后進(jìn)行性生長(zhǎng)阻滯，表現(xiàn)為成熟前衰老，由于損傷了神經(jīng)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞的自我更新能力，致使神經(jīng)和造血系統(tǒng)出現(xiàn)了嚴(yán)重的功能缺陷。雖然有報(bào)道指出Bmi-1基因敲除小鼠的中軸骨異常和骨髓脂肪細(xì)胞增加，但是

2、否由于損傷了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)的自我更新能力致使骨發(fā)生能力減低而引起骨質(zhì)疏松至今未見(jiàn)報(bào)道。 為了明確Bmi-1能否通過(guò)維持BM-MSC的自我更新能力，促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化，抑制其向脂肪細(xì)胞分化，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用，我們從整體、細(xì)胞和分子水平比較分析2周和4周齡的野生型和Bmi-1基因敲除小鼠的骨骼表型差異。 利用X-線攝影，微-CT掃描及三維重建分析發(fā)現(xiàn)2周和4周齡Bmi-1-/-小鼠長(zhǎng)骨短小，骨密度降低。

3、利用增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)免疫組化和TUNEL染色顯示4周齡Bmi-1-/-小鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增殖降低，凋亡增加。利用HE染色、總膠原染色、堿性磷酸酶(ALP)組化染色、Ⅰ型膠原免疫組化染色和鈣黃綠素雙標(biāo)發(fā)現(xiàn)2周和4周齡Bmi-1-/-小鼠骨容量降低，成骨細(xì)胞數(shù)減少，ALP和Ⅰ型膠原陽(yáng)性面積減少及礦物質(zhì)沉積率降低，而骨髓脂肪細(xì)胞數(shù)則明顯增加。這些改變?cè)?周齡時(shí)較2周齡更為明顯。與形態(tài)變化一致，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR結(jié)果顯示ALP、Ⅰ型

4、膠原和骨鈣素(OCN)基因表達(dá)水平在Bmi-1-/-小鼠骨組織中的表達(dá)均明顯下調(diào)；Western blot結(jié)果顯示主導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的基因產(chǎn)物核蛋白結(jié)合因子a1(Cbfal)在Bmi-1-/-小鼠骨組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，而主導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化的基因產(chǎn)物過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)則明顯上調(diào)。利用抗酒石酸鹽酸性磷酸酶(TRAP)組化染色和核因子κB配體的受體激活因子(RANKL)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)TRAP陽(yáng)性的破骨細(xì)胞數(shù)在Bmi-1-

5、/-小鼠和野生型小鼠之間無(wú)明顯差異。雖然RANKL的陽(yáng)性面積在Bmi-1-/-小小鼠的干骺端區(qū)域減少，但當(dāng)使用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)RANKL和護(hù)骨素(OPG)基因表達(dá)水平變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)兩者平行下降，而使RANKL/OPG比值與野生型小鼠相似。 通過(guò)BM-MSC培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)Bmi-1-/-小鼠骨髓細(xì)胞形成成纖維細(xì)胞集落形成單位(CFU-f)和ALP陽(yáng)性的CFU-f的效率明顯下降，形成脂肪細(xì)胞的效率明顯增加。通過(guò)碘化丙啶(PI)染色和

6、流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)Bmi-1-/-小鼠來(lái)源的BM-MSC增殖能力明顯降低，凋亡則明顯增加。通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CDKI包括p16、p19和p27在Bmi-1-/-小鼠來(lái)源的BM-MSC中均明顯上調(diào)。 本研究首次證明了Bmi-1缺失能通過(guò)損傷軟骨內(nèi)成骨和成骨細(xì)胞骨形成而引起骨骼生長(zhǎng)障礙和成熟前骨質(zhì)疏松。同時(shí)骨質(zhì)疏松的發(fā)生與Bmi-1缺失損傷了BM-MSC的增殖和向成骨細(xì)胞分化的能力有關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)不僅證實(shí)了Bmi-