山茶花APX、CPI、GA20ox1基因功能研究及木糖篩選體系建立.pdf

1、利用RT-PCR同源克隆以及3'，5'-RACE擴(kuò)增技術(shù)，從杜鵑紅山茶(Camellia azalea)嫩葉中分離獲得山茶花抗逆基因以及從云南山茶矮生品種‘恨天高’(C.reticulate Lindl.‘Hentiangao’)莖尖中分離獲得株型生長相關(guān)的同源基因cDNA全長序列，所分離的基因包括杜鵑紅山茶CaAPX（GenBank登錄號:KP635267）、杜鵑紅山茶CaCPI(GenBank登錄號:KP635269)以及‘恨天高’

2、CrGA20ox1（GenBank登錄號:KP635268）。序列分析及生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這些基因皆為所要分離的目的基因。
　　利用熒光定量Real-time RT-PCR技術(shù)，分別對CaAPX、 CaCPI以及CrGA20ox1的表達(dá)模式進(jìn)行了研究。CaAPX在杜鵑紅山茶7種檢測組織中均有表達(dá)，但表達(dá)水平不一，表達(dá)量由高到低依次為:未成熟果實＞嫩葉＞花苞＞葉芽＞種胚＞花瓣＞花芽，其中未成熟果實中的表達(dá)量最高，高達(dá)其他組織的2.

3、68～11.44倍。杜鵑紅山茶在溫度脅迫下的表達(dá)分析結(jié)果顯示，溫度脅迫可以誘導(dǎo)CaAPX表達(dá)量增加。CaCPI在杜鵑紅山茶嫩葉中的表達(dá)量最高，其次為莖，而根的表達(dá)量則較低，約為嫩葉的0.62倍。GA20ox1基因在4種不同株型的山茶中均得到表達(dá)，其中喬木類的浙江紅山茶(C.chekiangoleosa Hu) GA20ox1表達(dá)量最高，其次是岳麓連蕊茶(C.handelii Sealy)及金花茶（C.nitidissima Chi），表

4、達(dá)量最低的為矮生品種‘恨天高’，由此推測該基因的表達(dá)量高低與測試物種的株高有呈現(xiàn)正相關(guān)的趨勢。GA20ox1在4個物種不同組織中的表達(dá)模式基本一致，且莖尖組織中的表達(dá)量均高于葉片中的表達(dá)量，表明莖尖GA20ox1表達(dá)情況是決定株型高矮的主要因素之一。
　　通過酶切、連接的方法，利用pBI121表達(dá)載體，分別構(gòu)建了3個正義植物表達(dá)載體和1個反義植物表達(dá)載體，分別為正義CaAPX、正義CaCPI以及正、反義CrGA20ox1基因的表達(dá)

5、載體。農(nóng)桿菌介導(dǎo)，分別轉(zhuǎn)化煙草（Nicotiana tabacum L.cv.SR1），其中含正義CaAPX、正義CaCPI和正義CrGA20ox1基因的轉(zhuǎn)化陽性煙草各20株，含反義CrGA20ox1基因的轉(zhuǎn)化陽性煙草20株，共計獲得80株陽性植株。從以上經(jīng)過PCR鑒定為陽性的植株中各挑選3株，經(jīng)Southern雜交鑒定，均為陽性，說明目的基因成功整合至煙草基因組中。熒光定量Real-time RT-PCR分析表明，正義基因轉(zhuǎn)化煙草陽性

6、株系中的目的基因表達(dá)量顯著提高，其中正義CaAPX轉(zhuǎn)化煙草葉片CaAPX表達(dá)量高達(dá)82.44;正義CaCPI轉(zhuǎn)化煙草葉片CaCPI表達(dá)量高達(dá)95.23;正義CrGA20ox1轉(zhuǎn)化煙草葉片CrGA20ox1表達(dá)量高達(dá)108.02，而反義CrGA20ox1轉(zhuǎn)化煙草葉片表達(dá)量只有野生型的0.44倍。
　　溫度脅迫后發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)正義CaAPX可以提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒、耐熱性，以及在溫度脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草植株體內(nèi)與抗寒、耐熱能力呈正相關(guān)的

7、指標(biāo)增加趨勢較野生型明顯，而與抗寒、耐熱能力呈負(fù)相關(guān)的指標(biāo)增加趨勢則低于野生型。PCR檢測顯示CaAPX在T0及T1代穩(wěn)定遺傳，溫度脅迫下提高種子的抗寒、耐熱性及種子發(fā)芽率。
　　正義CaCPI轉(zhuǎn)化煙草陽性植株T1代幼苗經(jīng)PCR擴(kuò)增顯示，CaCPI在T0和T1代之間能夠遺傳表達(dá)。喂蟲實驗結(jié)果顯示，野生型煙草不能抵御同翅目桃蚜（Myzus persicae），過量表達(dá)正義CaCPI轉(zhuǎn)基因煙草則對蚜蟲具有較好的抵御能力，接蟲5d后植株

8、上的蚜蟲積累死亡率高達(dá)野生型的5.14倍。
　　經(jīng)形態(tài)指標(biāo)檢測結(jié)果可以看出，過量表達(dá)CrGA20ox1煙草植株明顯增高，而沉默表達(dá)CrGA20ox1煙草株高約為野生型的一半。內(nèi)源激素測定顯示，正義表達(dá)CrGA20ox1提高煙草內(nèi)源激素GA、IAA含量，而反義表達(dá)CrGA20ox1則抑制GA、IAA的合成;內(nèi)源激素ZR和ABA在正、反義CrGA20ox1轉(zhuǎn)化煙草體內(nèi)均變化不明顯。
　　木糖篩選系統(tǒng)應(yīng)用到煙草轉(zhuǎn)化中結(jié)果表明，xy