1、鐵調(diào)素(Hepcidin)是一種兼具抗菌和調(diào)節(jié)機(jī)體鐵代謝功能的抗菌肽。目前對Hepcidin調(diào)鐵功能的研究已經(jīng)很透徹，但是對豬源Hepcidin(Porcine Hepcidin，pHepc)的研究甚少。本試驗(yàn)對pHepc體外抗菌活性、抗菌機(jī)制及安全性進(jìn)行了評估，并通過胞內(nèi)菌和胞外菌感染豬腸道上皮細(xì)胞系IPEC-1、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2和豬肺泡巨噬細(xì)胞3D4/2，探究了pHepc在細(xì)菌感染宿主細(xì)胞中發(fā)揮的作用。圍繞此開展了以下試
2、驗(yàn):
試驗(yàn)一 pHepc體外抗菌活性及其機(jī)制的研究
試驗(yàn)采用瓊脂糖擴(kuò)散、菌落計(jì)數(shù)、透射電鏡和DNA凝膠電泳阻滯方法研究了pHepc對幾株常見致病菌的抗菌活性。研究發(fā)現(xiàn):①人工合成的pHepc對受試菌具有抑菌活性，能夠抑制所有受試菌的生長，并且存在劑量依賴效應(yīng)。其中，金黃葡萄球菌ATCC25923對pHepc最敏感，最高濃度的pHepc可以減少2 log CFU/ml金黃葡萄球菌ATCC25923細(xì)菌數(shù)量。相比之下，p
3、Hepc只減少1.5 log CFU/ml其他受試菌數(shù)量。②pHepc是豬內(nèi)源表達(dá)產(chǎn)生的，因此我們探究了不同生理基質(zhì)對pHepc抑菌活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pHepc具有廣泛的pH適應(yīng)條件，在pH6.0-8.0范圍內(nèi)可以抑制大腸桿菌K88，而對于金黃葡萄球菌能在略廣的pH范圍內(nèi)(pH4.0-8.0)發(fā)揮抑菌活性。但是用仔豬血清處理pHepc30 min后，肽的抑菌活性喪失。③由于pHepc在調(diào)節(jié)機(jī)體鐵代謝中發(fā)揮著重要功能，因此我們研究了鐵
4、對pHepc抑菌活性的影響。結(jié)果顯示:pHepc在較高的鐵離子濃度下仍然能發(fā)揮較強(qiáng)的抗菌活性，說明其抑菌活性并不依賴鐵離子。
進(jìn)一步對pHepc抑菌機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)pHepc可以提高大腸桿菌K88和金黃色葡萄球菌ATCC25923細(xì)菌表面疏水性。利用SYTOX攝取試驗(yàn)和透射電鏡觀察等方法揭示了pHepc同時(shí)存在膜作用機(jī)制和胞內(nèi)作用機(jī)制，且對細(xì)胞膜的破壞作用存在劑量依賴性，64μg/ml的pHepc使得受試菌膜均受到一定程度的破損
5、。pHepc作用細(xì)菌后，菌體電子密度分布不均一，兩級和中間出現(xiàn)空泡化，細(xì)菌內(nèi)容物泄露，還引起部分大腸桿菌K88菌體變長。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)pHepc能夠有效結(jié)合細(xì)菌質(zhì)粒DNA，抑制其遷移。
試驗(yàn)二 pHepc在細(xì)菌感染宿主細(xì)胞中發(fā)揮的作用研究
根據(jù)試驗(yàn)一的結(jié)果，我們選取胞外菌大腸桿菌K88和金黃色葡萄球菌ATCC25923，以及胞內(nèi)菌鼠傷寒沙門氏菌CMCC50013開展了細(xì)菌感染細(xì)胞試驗(yàn)。結(jié)果顯示:pHepc在胞內(nèi)菌和胞外菌
6、感染機(jī)體中發(fā)揮不同的作用。在胞外菌感染細(xì)胞試驗(yàn)中，相比于細(xì)菌感染組，陰性肽pHepcC-A（將pHepc的8個(gè)半胱氨酸全部替換為丙氨酸的直鏈肽）沒有減少受試菌粘附和入侵細(xì)胞的數(shù)量。而pHepc處理可以顯著減少大腸桿菌K88和金黃色葡萄球菌ATCC25923的細(xì)菌數(shù)量。通過光學(xué)顯微鏡鏡檢、吉姆薩染色和掃描電鏡觀察，結(jié)果表明:pHepc使得大腸桿菌K88發(fā)生聚集。相反的，對于胞內(nèi)菌鼠傷寒沙門氏菌CMCC50013，pHepc處理可顯著增加粘
7、附和入侵Caco-2細(xì)胞和3D4/2巨噬細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)量。通過在不同感染時(shí)間點(diǎn)統(tǒng)計(jì)入侵菌的數(shù)量結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)pHepc處理后，細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌繁殖明顯增加，提示可能與胞內(nèi)鐵離子濃度相關(guān)。進(jìn)一步的蛋白電泳結(jié)果顯示，pHepc處理使細(xì)胞膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Fpn發(fā)生了部分降解，使鐵的輸出受到抑制從而使胞內(nèi)鐵濃度升高。同時(shí)，用鐵螯合劑螯合細(xì)胞內(nèi)鐵離子后，胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量顯著減少，表明胞內(nèi)菌的生長是鐵依賴性的，pHepc處理后使胞內(nèi)細(xì)菌快速生長確實(shí)與胞內(nèi)鐵離子濃度存
8、在一定關(guān)系。鼠傷寒沙門氏菌CMCC50013感染巨噬細(xì)胞3D4/2的實(shí)驗(yàn)還顯示，pHepc處理顯著緩解感染引起的炎性細(xì)胞因子IL-1α、IL-6、IL-8、TNF-αmRNA表達(dá)量的上調(diào)(p＜0.05)。單獨(dú)添加pHepc和pHepcC-A均對細(xì)胞M1型極化標(biāo)志因子TNF-α、IL-6、IL-1β等分泌沒有顯著影響(p＞0.05)。
綜上，本研究結(jié)果表明，pHepc在豬體內(nèi)發(fā)揮著重要的抗菌功能，該研究可能對保障機(jī)體健康提供思路
