山莨菪堿抗休克作用的α7尼古丁受體和β-arrestins抗炎機(jī)制.pdf

1、目的：山莨菪堿是中國科學(xué)家1965年從茄科植物唐古特莨菪中提取出的生物堿,其人工合成品為654-2。山莨菪堿是托品酸和有機(jī)堿形成的酯類,結(jié)構(gòu)與阿托品和東莨菪堿相類似,在托品基的6位炭原子上有不對稱的羥基。山莨菪堿屬于非選擇性的毒蕈堿受體阻斷劑,能夠阻斷M1-M5受體亞型。因此,山莨菪堿有一系列相似于阿托品的藥理作用如抑制唾液分泌、抑制胃酸和汗液分泌,抑制胃腸蠕動及膀胱收縮、散瞳、擴(kuò)張支氣管。臨床上已經(jīng)用于由平滑肌痙攣、胃、十二指腸潰瘍、

2、膽道痙攣而引起的疼痛,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,胃潰瘍,急性腎小球腎炎,偏頭痛,過敏性紫癜,肺炎、有機(jī)磷酸酯類中毒的解救等多種疾病的治療。自1965年以來,山莨菪堿被用于治療循環(huán)性休克,特別是感染性休克的治療取得了很好的治療效果,如北京友誼醫(yī)院兒科使用山莨菪堿治療爆發(fā)型流行性腦脊髓膜炎,使死亡率從66.9％下降到12.4％,用山莨菪堿治療中毒性細(xì)菌性痢疾,使死亡率從20-30％下降到0.5％。目前關(guān)于山莨菪堿抗休克的機(jī)制主要包括改善微循環(huán)；抑制血

3、栓形成和纖維蛋白溶解作用；穩(wěn)定溶酶體及抑制組織蛋白酶等,但是其相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制很少報(bào)道。 Wang等報(bào)道乙酰膽堿與巨嗜細(xì)胞上尼古丁受體結(jié)合能夠抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎性因子TNFα,IL-1β,IL-6,IL-18等分泌。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿的作用主要是通過與巨嗜細(xì)胞上的α7尼古丁受體結(jié)合,通過細(xì)胞內(nèi)一系列的信號傳遞,最終抑制了Jak2-STAT3和NF-kB信號的激活,從而抑制了炎癥因子的產(chǎn)生。在內(nèi)毒素休克大鼠模型中,切斷迷走

4、神經(jīng)能夠明顯加重內(nèi)毒素誘導(dǎo)的休克反應(yīng),動物對內(nèi)毒素的致死效應(yīng)更加敏感。直接刺激迷走神經(jīng)能夠降低內(nèi)毒素血癥大鼠血漿和組織中TNFα和IL-6的含量,阻止血壓的持續(xù)下降,減緩內(nèi)毒素引起的低血壓休克的發(fā)生時相。由于乙酰膽堿是迷走神經(jīng)末梢分泌的主要神經(jīng)遞質(zhì),因此,他們把這條通路命名為膽堿能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway)。膽堿能抗炎通路是通過神經(jīng)來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)程度的重要通路。山莨菪堿是非選擇

5、性的M受體阻斷劑,因此,我們的第一個假設(shè)是：山莨菪堿通過阻斷M受體,使迷走神經(jīng)分泌的乙酰膽堿更多的與α7尼古丁受體結(jié)合激活了膽堿能抗炎通路,發(fā)揮了抗休克作用。β-arrestins是一組多功能的小分子蛋白質(zhì),它的經(jīng)典作用是參與G蛋白偶聯(lián)受體的脫敏。但是近年來的研究發(fā)現(xiàn),β-arrestins作為腳手架蛋白,也參與了許多非G蛋白偶聯(lián)受體激活的信號傳導(dǎo),如ERK,JNK,p38,Akt和PI3激酶信號通路等,因此β-arrestins也參與

6、了趨化作用,凋亡作用及腫瘤轉(zhuǎn)移等過程。2006年,Nature上報(bào)道了β-arrestins可以和TRAF6結(jié)合,負(fù)向調(diào)節(jié)內(nèi)毒素休克時的信號傳導(dǎo)通路--TLR-IL-1R(toll-likereceptor-interleuldn-1 receptor)信號通路,最終抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-kB及AP-1的活化,從而抑制炎癥因子的產(chǎn)生。此外,Witherow等報(bào)道了β-arrestins,特別是β-arrestin-1能夠直接與NF-kB的抑

7、制因子IKBα結(jié)合,使得IKBα-NF-kB復(fù)合體滯留在胞漿中,從而阻止NF-kB進(jìn)入細(xì)胞核而抑制其活化。Gao等研究發(fā)現(xiàn)β-arrestin-2能夠與IkBα結(jié)合,抑制IkBα的磷酸化降解,從而抑制NF-kB信號的激活及炎癥因子的表達(dá),并發(fā)現(xiàn)刺激β2腎上腺素能受體能夠加強(qiáng)β-arrestin2-IkBα復(fù)合體的穩(wěn)定,從而為交感系統(tǒng)的抗炎作用提供了理論依據(jù)。Luan等的研究發(fā)現(xiàn)β-arrestin-2能夠與IkBα結(jié)合,抑制紫外線照射引

8、發(fā)的NF-kB信號活化。阮等的研究發(fā)現(xiàn)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,山莨菪堿能夠抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活化,山莨菪堿也能夠完全阻斷內(nèi)毒素誘導(dǎo)的NF-kB活化。因此,我們的第二個假設(shè)是：山莨菪堿增加了β-arrestins蛋白的表達(dá),β-arrestins蛋白表達(dá)增加抑制了NF-kB信號的活化,參與了與山莨菪堿的抗休克作用。 方法：本研究以內(nèi)毒素誘導(dǎo)的休克為模型,研究了α7尼古丁受體阻斷劑甲基牛扁堿對山莨菪堿抗休克作用的影響；在受體結(jié)合實(shí)

9、驗(yàn)中,利用激光共聚焦觀察了山莨菪堿對乙酰膽堿與α7尼古丁受體結(jié)合的影響；在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的RAW264.7巨嗜細(xì)胞,利用分子生物學(xué)技術(shù)研究了山莨菪堿對RAW264.7巨嗜細(xì)胞β-arrestin-1蛋白表達(dá)的影響及β-arrestin-1蛋白在山莨菪堿抗休克中的作用。 結(jié)果： 第一部分：山莨菪堿通過激活膽堿能抗炎通路發(fā)揮了抗休克作用 1、α7尼古丁受體特異性阻斷劑甲基牛扁堿顯著地阻斷了山莨菪堿對大鼠內(nèi)毒素休克低血壓的

10、改善作用,同時也阻斷了山莨菪堿降低內(nèi)毒素休克大鼠血清和肝臟炎性細(xì)胞因子TNFα和IL-1β水平的作用；甲基牛扁堿也能顯著地阻斷山莨菪堿改善內(nèi)毒素休克小鼠存活率的作用；在單側(cè)迷走神經(jīng)切斷的小鼠模型上,山莨菪堿的抗休克作用下降；α7尼古丁受體基因敲除的小鼠與其野生對照小鼠相比,山莨菪堿降低內(nèi)毒素休克小鼠血清中TNFα和IL-1β的作用顯著下降。這些結(jié)果說明α7尼古丁受體參與了山莨菪堿的抗休克作用。 2、受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,在RAW

11、264.7巨嗜細(xì)胞,山莨菪堿能夠通過阻斷M受體,增加乙酰膽堿與α7尼古丁受體結(jié)合的數(shù)量；以α7尼古丁受體基因敲除小鼠和其野生對照小鼠的腹腔巨嗜細(xì)胞為模型,發(fā)現(xiàn)在野生小鼠的腹腔巨嗜細(xì)胞,山莨菪堿能夠加強(qiáng)乙酰膽堿抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)TNFα分泌的作用,但是在α7尼古丁受體基因敲除小鼠的腹腔巨嗜細(xì)胞,山莨菪堿則沒有此作用。 第二部分：山莨菪堿通過增加β-arrestin-1蛋白的表達(dá)發(fā)揮了抗休克作用 1、在培養(yǎng)的RAW264.7巨嗜

12、細(xì)胞,山莨菪堿能夠劑量和時間依賴性地上調(diào)β-arrestin-1蛋白和mRNA表達(dá)；山莨菪堿的這個作用能夠被蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮和防線菌素D阻斷；山莨菪堿也能夠顯著的逆轉(zhuǎn)由內(nèi)毒素引起的細(xì)胞內(nèi)cAMP含量下降；用cAMP-PKA信號通路的特異性阻斷劑H-89預(yù)處理細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)山莨菪堿上調(diào)β-arrestin-1的作用被阻斷；以內(nèi)毒素誘導(dǎo)的休克小鼠為模型,山莨菪堿能夠顯著增加脾臟β-arrestin-1的表達(dá)。 2、在β-arr