溶葡萄球菌酶高效裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的機(jī)制研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌（金葡菌）是人類主要的病原菌，它能引起肺炎、骨髓炎、心內(nèi)膜炎及敗血癥等多種感染性疾病。隨著各種廣譜抗菌藥物在臨床的大量不合理使用，導(dǎo)致金葡菌對(duì)抗生素高度耐藥，造成臨床治療上的困難及病死率增高，嚴(yán)重威脅人類健康。因此，在合理使用抗生素的同時(shí)，也迫切需要開發(fā)與傳統(tǒng)抗生素作用模式不同的新型抗菌藥物。
　　溶葡萄球菌酶是一種由模仿葡萄球菌分泌的肽聚糖水解酶，能高效裂解金葡菌細(xì)胞壁。目前，它作為新型抗菌劑已進(jìn)入臨床研究用于治療

2、創(chuàng)面金葡菌感染。該酶由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成:N-端催化結(jié)構(gòu)域（催化區(qū)）和C-端細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域（結(jié)合區(qū)）。在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)中，目前只有上述兩個(gè)結(jié)構(gòu)域同源類似物的晶體結(jié)構(gòu)，即LytM（金葡菌分泌的一種自溶酶）的催化區(qū)(PDB:2B13)和ALE-1（頭狀葡萄球菌分泌的一種肽聚糖水解酶）的結(jié)合區(qū)(PDB:1R77)，它們與溶葡萄球菌酶的催化區(qū)和結(jié)合區(qū)分別具有63％和89％的相似性。然而，至今還未見溶葡萄球菌酶晶體結(jié)構(gòu)的報(bào)道。
　　

3、為了研究溶葡萄球菌酶如何高效裂解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖，我們展開了系列研究。首先，分別表達(dá)和純化溶葡萄球菌酶及其兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，并且檢測(cè)了它們的生物活性，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)催化區(qū)在低鹽濃度下具有很強(qiáng)的溶菌活性，但其活性隨離子強(qiáng)度的上升而顯著下降，當(dāng)環(huán)境中NaCI濃度提高至50 mM時(shí)，它的溶菌活性只有原來的1％;然而全長(zhǎng)溶葡萄球菌酶的溶菌活性受離子強(qiáng)度的干擾非常小;單獨(dú)結(jié)合區(qū)具有與金葡菌非常強(qiáng)的親和力，與催化區(qū)不同的是，即使在生理鹽濃度(150 mM Na

4、CI)下，結(jié)合區(qū)還保持很強(qiáng)的親和力，說明結(jié)合區(qū)和催化區(qū)的組合可以顯著提高溶葡萄球菌酶的溶菌活性，并耐受環(huán)境（比如鹽離子）的影響。
　　為進(jìn)一步了解兩個(gè)結(jié)構(gòu)域是如何組合在一起發(fā)揮高效溶菌活性，我們用同源模建的方法，構(gòu)建了溶葡萄球菌酶催化區(qū)和結(jié)合區(qū)的三維結(jié)構(gòu)模型，并通過蛋白，蛋白分子對(duì)接方法，計(jì)算預(yù)測(cè)溶葡萄球菌酶兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的對(duì)接方式，發(fā)現(xiàn)在自由能最低的前20個(gè)結(jié)構(gòu)中，溶葡萄球菌酶兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間沒有特定的相互作用界面，催化區(qū)隨機(jī)分布

5、在結(jié)合區(qū)的各個(gè)方位，說明計(jì)算方法并不適合預(yù)測(cè)溶葡萄球菌酶兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間對(duì)接模型。
　　隨后，我們用實(shí)驗(yàn)的方法鑒定溶葡萄球菌酶兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的相互作用界面，應(yīng)用氫氘交換質(zhì)譜法比較全長(zhǎng)溶葡萄球菌酶和它兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間氫氘交換率的變化，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)肽段(aa.331-339、248-260、454-473和474-488)的氫氘交換率在全長(zhǎng)溶葡萄球菌酶中變慢，表明這些肽段可能參與溶葡萄球菌酶兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間相互作用界面的形成。為了驗(yàn)證哪些肽段

6、確實(shí)參與界面的形成，我們通過位點(diǎn)特異二硫鍵交聯(lián)方法分析肽段之間的交聯(lián)反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)雙半胱氨酸突變體（K332C/T464C和K336C/T464C)能夠很好的形成二硫鍵，它們的突變位點(diǎn)分別位于肽段331-339（催化區(qū)）和肽段454-473（結(jié)合區(qū)）上，證明這兩個(gè)肽段在全長(zhǎng)溶葡萄球菌酶分子中緊靠在一起，說明溶葡萄球菌酶的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在溶液中通過這兩個(gè)肽段相互作用形成了結(jié)構(gòu)域之間的界面，此時(shí)催化區(qū)和結(jié)合區(qū)的活性中心處于同一個(gè)平面，有利于它

7、們同時(shí)與底物結(jié)合。
　　為了研究二硫鍵的形成對(duì)突變體（結(jié)構(gòu)域之間受到限制）生物活性產(chǎn)生的影響，我們比較了突變體(K332C/T464C)和野生型溶葡萄球菌酶與金葡菌細(xì)胞壁的親和力以及它們的溶菌活性。發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)受限的突變體與金葡菌細(xì)胞壁的親和力沒有改變，然而溶菌活性顯著下降，尤其是在高鹽環(huán)境下。為了確認(rèn)是二硫鍵產(chǎn)生的影響，我們用DTT打開突變體分子中的二硫鍵，消除兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的限制，發(fā)現(xiàn)它的溶菌活性又完全恢復(fù)，提示溶葡萄球菌酶兩個(gè)結(jié)

8、構(gòu)域之間在一定范圍內(nèi)可以相對(duì)運(yùn)動(dòng)是該酶高效裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的一個(gè)重要因素。
　　之前研究人員已經(jīng)證明肽聚糖是一個(gè)具有彈性的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在不同離子強(qiáng)度條件下可以收縮或者伸展。當(dāng)環(huán)境鹽濃度升高，細(xì)菌細(xì)胞壁收縮，肽聚糖變得松散和無規(guī)則，溶葡萄球菌酶兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)可以幫助催化區(qū)迅速調(diào)整位置，結(jié)合并水解細(xì)胞壁上的底物，從而實(shí)現(xiàn)高效裂解細(xì)菌細(xì)胞壁。
　　本研究有助于我們更好地理解溶葡萄球菌酶高效裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的作用機(jī)制。根據(jù)獲得