TNF阻斷劑抑制樹突狀細(xì)胞吞噬自身造血前體細(xì)胞.pdf

1、目的： 嗜血細(xì)胞綜合癥(Hemophagocytic Syndrome，HPS)是以單核細(xì)胞、吞噬細(xì)胞系增殖為特征的組織細(xì)胞增多癥。近來的研究表明HPS中的吞噬細(xì)胞可能是樹突狀細(xì)胞，而且HPS患者腫瘤壞死因子(TNF-α)增加。在體外實驗中，誘導(dǎo)CD34<'+>造血干．前體細(xì)胞向紅系分化過程中加入TNF-α則產(chǎn)生樹突狀細(xì)胞(DC)，而樹突狀細(xì)胞吞噬紅系前體細(xì)胞。本研究探討在TNF-α誘導(dǎo)CD34<'+>細(xì)胞過程中TNF阻斷劑的作

2、用。為探討TNF阻斷劑在HPS治療中的作用奠定基礎(chǔ)。 材料和方法： 一、試劑 牛血清白蛋白(BSA)，Iseove’s Modified Dulbeceo’s Medium(IMDM)及propidium iodide(PI)購自Sigma公司(St Louis，MO，USA)。胎牛血清(FCS)購自Hyclone公司(Tokyo，Japan)。青霉素，鏈霉素購自Flow Laboratories Inc．(Mc

3、Lean，VA)。重組人EPO購自Chugai Pharmaceutical Co．(Tokyo，Japan)。重組人IL-3和SCF由kirin Brewery公司惠贈(Tokyo，Japan)。胰島素(豬鈉鹽結(jié)晶，活性26.3u/mg美國藥典)購自Wako Pure Chemical Industries(Osaka，Japan)。維生素B12購自Eisai公司(Tokyo，Japan)。葉酸購自日本武田藥品工業(yè)株式會社(Osaka

4、，Japan)。重組人TNF-α購自R&D公司(Minneapolis，MN)。Etanercept由日本武田藥品工業(yè)株式會社惠贈(Tokyo，Japan)。Infliximab由日本田邊制藥株式會社惠贈(Kyoto，Japan)。異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗血型糖蛋白A(GPA-FITC)購自Becton Dickinson公司(Franklin Lakes，NJ)。異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CD11c(CD11c-FIT

5、C)購自Dako公司(Kyoto，Japan)。藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的CD11c(CD11c-PE)購自Beckman Coulter公司(Tokyo，Japan)。藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的CD4(CD4-PE)，CD123(CD123-PE)和異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CD4(CD4-FITC)購自BD Pharmi ngen公司(Tokyo，Japan)。 二、人CD34+細(xì)胞的制備 給正常健康志愿者注射重組人粒

6、細(xì)胞刺激因子(G-CSF)，動員CD34<'+>細(xì)胞進(jìn)入外周血，用CliniMACS細(xì)胞分離機(jī)分離并純化CD34<'+>細(xì)胞，置液氮中保存?zhèn)溆谩?三、純化CD34+細(xì)胞的液體懸浮培養(yǎng) 利用純化CD34<'+>細(xì)胞向紅系誘導(dǎo)分化的方法。將凍結(jié)的純化CD34<'+>細(xì)胞于37℃水浴解凍，懸浮于IMDM(含20％FCS)中，然后在400g，4℃下高速離心5min，除去上清，用含有10％FCS的IMDM及含有0.3％BSA的IM

7、DM洗細(xì)胞2次，再懸浮于0.3％BSA的IMDM中。細(xì)胞數(shù)為1×10<'6>/ml。將上述細(xì)胞懸浮于下列試劑的混合物中：20％FCS，10％熱滅活庫存人AB血清，1％BSA，胰島素10 μ g/ml，維生素B120.5 μ g/ml，葉酸15 μ g/ml，β-ME 1.25 × 10<'-5>mol/ml，IL-3 10ng/ml，SCF10ng/ml，EPO 2U/ml，青霉素50U/ml，鏈霉素50U/ml和IMDM。細(xì)胞濃度為2

8、 × 10<'4>-4× 10<'4>/ml。TNF阻斷劑應(yīng)用Etanercept和Infliximab。在37℃，5％C02恒溫箱中孵育規(guī)定的天數(shù)后收集細(xì)胞，用含0.3％BSA的IMDM洗細(xì)胞2次，計數(shù)細(xì)胞并測定細(xì)胞表面標(biāo)記。 四、細(xì)胞涂片標(biāo)本的制作 取培養(yǎng)后的細(xì)胞懸液少許經(jīng)甩片機(jī)(cytospin)制成細(xì)胞標(biāo)本，風(fēng)干后行May-Giemsa染色。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。 五、流式細(xì)胞儀分析 細(xì)胞由染色介