調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在自身免疫性卵巢早衰發(fā)生發(fā)展中的作用.pdf

1、研究背景及目的:
　　卵巢早衰(Premature Ovarian Failure)是指女性40周歲之前因性腺功能衰竭,伴促性腺激素增高、雌激素低下,可有一系列圍絕經(jīng)的臨床表現(xiàn),如潮熱、多汗、不孕等癥狀。40歲以下女性的發(fā)病率約為1％,在30歲以下女性的發(fā)病率約為0.1%,在20歲以下女性的發(fā)病率約為0.01%。POF患者不僅生育力低下,且易提前出現(xiàn)骨質(zhì)疏松、心血管疾病及帕金森等并發(fā)癥,癌癥相關(guān)發(fā)病率增高1.29倍,合并自身免疫系

2、統(tǒng)疾病增高1.56倍,死亡率高達(dá)普通人群的兩倍。因此,對(duì)卵巢早衰的研究越來越受到臨床關(guān)注。
　　目前,POF病因和發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。染色體變異,自身免疫、代謝異常或藥物作用、放射損害、病毒感染等因素可能與POF的發(fā)生有關(guān)。自1968年有學(xué)者提出POF與自身免疫性疾病有關(guān),迄今認(rèn)為30%的病因與自身免疫調(diào)節(jié)異常相關(guān).而自身免疫性卵巢疾病(Autoimmune ovarian disease AOD)可能是POF發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制,

3、AOD疾病的病理學(xué)表現(xiàn)為炎性細(xì)胞對(duì)卵巢內(nèi)卵泡及間質(zhì)的侵潤,致使卵巢結(jié)構(gòu)紊亂,卵泡缺失,閉鎖。新生期第2-5天切除易感品系小鼠胸腺可以誘導(dǎo)AOD的發(fā)生。胸腺是CD4+T淋巴細(xì)胞分化、發(fā)育和成熟的場所,胸腺來源的具有免疫抑制作用的CD4+CD25+T,稱為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells Treg)能夠調(diào)節(jié)天然和適應(yīng)性免疫應(yīng)答,參與免疫負(fù)調(diào)節(jié)和免疫耐受,對(duì)機(jī)體免疫環(huán)境的穩(wěn)定起到重要作用。因此探討CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)

4、胞( Regulatory T cells,Treg)在自身免疫性卵巢疾病(Autoimmune ovarian disease AOD)的發(fā)病機(jī)制十分重要,為人類POF的診斷、發(fā)病機(jī)制及其治療方法提供線索。
　　研究方法:
　　出生第3天乳鼠行胸腺摘除術(shù)(Thymectomized on day3 of life,D3tx)建立D3tx組和假手術(shù)組,免疫組織化學(xué)觀察小鼠卵巢形態(tài)學(xué)改變, ELISA檢測血清性激素變化,流式細(xì)

5、胞學(xué)檢測D3tx術(shù)后不同時(shí)期小鼠外周血Treg比例變化及AOD小鼠外周血及不同區(qū)域淋巴結(jié)中T細(xì)胞亞群和Treg細(xì)胞百分比的變化。并通過免疫磁珠分選出CD4+CD25+T細(xì)胞,過繼轉(zhuǎn)移到D3tx小鼠體內(nèi),觀察疾病的轉(zhuǎn)歸情況。
　　結(jié)果:
　　1) ELISA檢測術(shù)后5-9周小鼠血清性激素變化,結(jié)果顯示D3tx小鼠FSH明顯高于假手術(shù)組,E2、LH顯著低于假手術(shù)組。
　　2)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示 D3tx小鼠在術(shù)后第5

6、周卵巢開始出現(xiàn)炎細(xì)胞的侵潤及卵泡閉鎖,隨時(shí)間的推移,炎細(xì)胞侵潤及閉鎖卵泡數(shù)目明顯增加,卵泡結(jié)構(gòu)層次更加紊亂,疾病嚴(yán)重程度逐漸加劇,到第8周時(shí)81.5%的卵巢病理表現(xiàn)為4級(jí)。
　　3)流式細(xì)胞檢測不同時(shí)期小鼠外周血中 Treg/CD4+的比例,結(jié)果顯示 D3tx小鼠術(shù)后1-2周外周血中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+快速上升,到第2周時(shí)達(dá)到峰值,后快速下降至第3周,此后逐漸緩慢下降,至第9周時(shí)仍高于假手術(shù)組。
　　4)

7、流式細(xì)胞檢測AOD小鼠外周血及不同淋巴結(jié)中T淋巴細(xì)胞亞群和Treg細(xì)胞百分比的變化,結(jié)果顯示,AOD小鼠體內(nèi)CD3+/lymphocyte在外周血及不同淋巴結(jié)中均明顯低于假手術(shù)組,但 CD4+CD25+Foxp3+/CD4+在外周血及不同淋巴結(jié)中均明顯高于假手術(shù)組。
　　5)經(jīng)免疫磁珠分選后,提取高純度Treg過繼轉(zhuǎn)移至術(shù)后3天的D3tx小鼠體內(nèi),術(shù)后8周,血清性激素提示Treg過繼轉(zhuǎn)移后小鼠FSH明顯下降,E2明顯增高。卵巢切片

8、經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后卵巢內(nèi)可見卵泡,且卵巢區(qū)域淋巴結(jié)來源的 Treg對(duì)預(yù)防AOD發(fā)生的效果更加顯著。
　　6)流式細(xì)胞學(xué)檢測Treg過繼轉(zhuǎn)移后小鼠外周血及不同淋巴結(jié)中T淋巴細(xì)胞亞群和 Treg細(xì)胞百分比的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過繼轉(zhuǎn)移組小鼠外周血及脾臟中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+的比值明顯高于未過繼轉(zhuǎn)移小鼠,但在腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)及腹股溝淋巴結(jié)中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Treg過繼轉(zhuǎn)移后小鼠與未過

9、繼轉(zhuǎn)移組小鼠在外周血、脾臟、腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)及腹股溝淋巴結(jié)中 CD3+/lymphocyte、CD4+/CD3+、CD8+/CD3+、CD4+/CD8+的比值均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　D3tx小鼠誘導(dǎo)的自身免疫性卵巢疾病在血清性激素及卵巢形態(tài)學(xué)改變均與人類POF相似,可以作為人類研究自身免疫性POF動(dòng)物模型。AOD表現(xiàn)以T淋巴細(xì)胞持續(xù)減少為主,伴有外周血和淋巴組織中 CD4+CD25+Foxp3+/CD4+比例增

10、高及卵巢內(nèi)CD4+、Foxp3+表達(dá)上調(diào)。推測D3tx小鼠體內(nèi)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+增高可能是外周免疫器官內(nèi)靜息的CD4+T細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成iTreg,參與局部炎癥反應(yīng),抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞,但是D3tx小鼠體內(nèi)增高的自身內(nèi)源性Treg可能不足以抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞增殖,則導(dǎo)致AOD的發(fā)生。過繼轉(zhuǎn)移正常雌鼠CD4+CD25+Treg至D3tx體內(nèi), Treg的大量增加至完全能夠抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞時(shí), AOD的發(fā)生得到