孕婦外周血中HLA-G標(biāo)識(shí)的胎兒細(xì)胞數(shù)量與妊娠期高血壓疾病的相關(guān)性研究.pdf

1、妊娠期高血壓疾病是病理性妊娠常見疾病。盡管此病在妊娠晚期發(fā)病，但其發(fā)病因素可能在妊娠早期胎盤形成過程中就已存在，其發(fā)展最終累及胎盤、胎兒和孕婦各主要臟器。目前尚沒有一種方法能在臨床發(fā)病前，即妊娠早期預(yù)測(cè)該疾病的發(fā)生。近年來，從孕婦外周血中分離出胎兒細(xì)胞用于非侵入性產(chǎn)前診斷備受關(guān)注。孕婦外周血中胎兒細(xì)胞包括胚胎源性的（有核紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞）以及胚外源性的（滋養(yǎng)細(xì)胞），經(jīng)富集后，這些細(xì)胞可用于非侵入性產(chǎn)前診斷。滋養(yǎng)細(xì)胞因在妊娠中形成很早，在

2、侵入和增殖過程中進(jìn)入母血，且在分娩后迅速被母體清除，因此，具有用于產(chǎn)前診斷的優(yōu)勢(shì)。但因缺乏標(biāo)識(shí)滋養(yǎng)細(xì)胞的特異性抗體，有關(guān)成功富集循環(huán)中滋養(yǎng)細(xì)胞的研究報(bào)道很少。絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞不表達(dá)經(jīng)典的主要組織相容性復(fù)合物（majorhistocompability complex，MHC）Ⅰ類和Ⅱ類抗原，但選擇性表達(dá)非經(jīng)典的MHCⅠ類抗原——人類白細(xì)胞抗原G（human leucocyte antigen–G，HLA-G）。這種特異性表達(dá)提示HLA

3、-G在母胎界面的重要作用。本研究以HLA-G特異性單克隆抗體MEM-G/9來標(biāo)識(shí)孕婦外周血中絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞，構(gòu)建一種HLA-G陽性表達(dá)胎兒細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色-顯微操作標(biāo)識(shí)和分選方法，通過比較正常妊娠與妊娠期高血壓疾病孕婦外周血中絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量，探討孕婦外周血中HLA-G陽性表達(dá)胎兒細(xì)胞的數(shù)量與妊娠期高血壓疾病的相關(guān)性，從而為妊娠期高血壓疾病的早期診斷提供依據(jù)。 第一部分HLA-G作為孕婦外周血中胎兒細(xì)胞特異性抗原

4、標(biāo)記物的研究 目的：建立利用滋養(yǎng)細(xì)胞表面抗原HLA-G進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，標(biāo)記母血中胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞的方法。建立高純度、高特異性的細(xì)胞分選技術(shù)。 方法:采集正常妊娠、妊娠期高血壓疾病、健康未孕女性外周血及新生兒臍帶血，經(jīng)密度梯度離心初步富集后涂片，用MEM-G/9（HLA-G單克隆抗體）進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，標(biāo)記胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞。 結(jié)果:正常妊娠、妊娠期高血壓疾病外周血及新生兒臍帶血中均觀察到黃染的胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞。陽性標(biāo)

5、記的胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞具有鮮明的形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)特征。滋養(yǎng)細(xì)胞單核，細(xì)胞呈類圓形，直徑大于陰性細(xì)胞（孕婦外周血單個(gè)核細(xì)胞），核大，染色質(zhì)凝聚，胞漿較少，胞漿均勻黃染。母源性細(xì)胞胞漿無著色，與滋養(yǎng)細(xì)胞形成對(duì)比。 結(jié)論:以HLA-G作為分選標(biāo)志，可以有效標(biāo)記母血中胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞，為后繼準(zhǔn)確、特異的細(xì)胞來源鑒定奠定基礎(chǔ)。 第二部分顯微操作分選-應(yīng)用Y 染色體上的性別決定區(qū)序列鑒定母血中胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞 目的：探索Y 染色體上的性別決

6、定區(qū)（sex-determining region of Y-chromosome，SRY）序列位點(diǎn)在無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中用于胎兒細(xì)胞鑒定、性別判斷的可行性。鑒定免疫細(xì)胞化學(xué)所標(biāo)記陽性細(xì)胞的胎兒源性。 方法:健康男性及健康未孕女性外周血各8例，以顯微操作技術(shù)挑取外周血單個(gè)核細(xì)胞。采用引物延伸預(yù)擴(kuò)增（primer extension preamplification，PEP）及聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain react

7、ion，PCR）技術(shù)檢測(cè)SRY基因。同樣用所建立的方法，挑取妊娠期高血壓疾病病例中免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記的陽性細(xì)胞，鑒定其胎兒源性。 結(jié)果:8例健康男性外周血均檢測(cè)有SRY基因，8例健康未孕女性外周血均未檢測(cè)出SRY基因。對(duì)妊娠期高血壓疾病病例中陽性細(xì)胞進(jìn)行SRY基因的PEP-PCR檢測(cè)，男胎檢出率為100％（10/10），女胎未檢出率為100％（8/8）。單細(xì)胞SRY基因的檢測(cè)結(jié)果與胎兒實(shí)際性別的符合率為100％，敏感性為100％，

8、特異性為100％。 結(jié)論:PEP-PCR技術(shù)可有效、準(zhǔn)確的鑒定單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞源性。免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記的陽性細(xì)胞是母血中胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞。以HLA-G為分選標(biāo)志，結(jié)合顯微操作分選技術(shù)，可以有效獲取高純度的胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞。 第三部分孕婦外周血中HLA-G 標(biāo)識(shí)的胎兒細(xì)胞數(shù)量與妊娠期高血壓疾病的相關(guān)性研究 目的：探討孕婦外周血中滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目是否與妊娠期高血壓疾病存在相關(guān)性。 方法:對(duì)18例35～40孕周的妊娠期高血壓疾

9、病孕婦，16例36～40孕周的正常妊娠孕婦外周血經(jīng)密度梯度離心后涂片，用MEM-G/9進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，計(jì)數(shù)黃染的滋養(yǎng)細(xì)胞。比較兩組病例的滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量差異。 結(jié)果:在6ml外周血中，正常妊娠病例HLA-G陽性細(xì)胞數(shù)為6.88±1.54，妊娠期高血壓疾病病例HLA-G 陽性細(xì)胞數(shù)為30.56±5.16，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001）。 結(jié)論:妊娠期高血壓疾病孕婦外周血中滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)顯著高于正常妊娠。孕婦外周血中滋