糖尿病對口腔種植體骨整合影響的作用機制研究.pdf

1、目的:口腔種植是治療缺牙患者的最有效途徑。Branemark在1971提出的“骨結(jié)合Osseointegration”概念成為種植體成功的最重要標準。穩(wěn)定的骨結(jié)合依賴于成骨細胞在種植體表面的粘附和增殖分化，這一過程受到多種局部和全身因素的影響。糖尿病作為口腔種植治療的相對禁忌癥，一直受到學者們的關(guān)注，被公認為是影響種植體骨結(jié)合的最重要系統(tǒng)因素之一。本研究擬從體外實驗觀察高糖對MC3T3-E1細胞增殖、成骨分化的影響，并分析PI3K/Ak

2、t信號通路在其中的調(diào)節(jié)作用機制;從體內(nèi)實驗，通過糖尿病大鼠模型，檢測不同血糖水平大鼠種植體周圍骨組織變化及整合素α5β1和纖維粘連蛋白(FN)表達水平，綜合評價糖尿病對種植體骨結(jié)合影響的作用機制。
　　方法:體外實驗:PI3K/AKT通路對不同高糖狀態(tài)下MC3T3-E1細胞成骨分化的影響.根據(jù)文獻選取四種培養(yǎng)基糖濃度:5.5mmol/L，15.5mmol/L，25.5mmol/L，35.5mmol/L，分別模擬人體內(nèi)正常生理糖濃度

3、及不同程度高血糖濃度，并根據(jù)是否添加PI3K/AKT通路抑制劑LY294002來分為八組:1）5.5mM糖濃度組(5.5mM-);2)15.5mM糖濃度組（15.5mM-）;3)25.5mM糖濃度組(25.5mM-);4）35.5mM糖濃度組(35.5mM-);5）5.5mM糖濃度+LY294002組(5.5mM+);6)15.5mM糖濃度+ LY294002組(15.5mM+);7)25.5mM糖濃度+LY294002組(25.5mM

4、+);8)35.5mM糖濃度+LY294002組(35.5mM+);其中，5.5mM糖濃度組(5.5mM)為對照組。甲基噻唑基四唑(MTT)法測定1d，3d的細胞增殖;堿性磷酸酶(ALP)活性檢測3d，7d的細胞分化情況;茜素紅染色觀察7d，14d細胞分泌鈣結(jié)節(jié)的情況;熒光實時定量PCR測定Run mRNA和OCN mRNA基因分別在3d、7d的表達;蛋白免疫印跡(Western blot)檢測3d、7d磷酸化蛋白激酶(p-Akt)的表

5、達。
　　體內(nèi)實驗:糖尿病大鼠種植體周圍骨結(jié)合的機制研究
　　33只3月齡雄性健康ZDF(Zucker diabetic fatty)大鼠隨機分為3組，每組11只，每只大鼠植入2顆種植體。A組:對照組，ZDF大鼠皮下注射等量生理鹽水，直接植入種植體（11只大鼠，22顆種植體）;B組:ZDF大鼠接受艾塞那肽緩釋納米球治療（皮下注射，0.74％，0.1ml/100g），并同時植入種植體(11只大鼠，22顆種植體);C組:ZDF大

6、鼠接受艾塞那肽緩釋納米球治療（皮下注射，0.74％，0.1ml/100g），至血清葡萄糖維持在恒定水平(≤16mmol/L)，然后植入種植體（11只大鼠，22顆種植體）。
　　種植手術(shù)后，在第7d、14d、30d、60d分批次處死大鼠，外科手術(shù)取出雙側(cè)股骨，去凈肌肉、粘膜等軟組織，隨后使用切割鉆切取種植體近遠中3mm的范圍的骨塊，從而得到一個包含種植體的長方形骨塊標本（第7d，標本數(shù)n=4個/每組，第14d、30d、60d，標本數(shù)

7、分別為n=6個/每組）。
　　通過硬組織切片、HE染色觀察種植體周圍骨代謝狀況，并通過免疫組化檢測種植體周圍整合素α5β1和纖維粘連蛋白的表達。
　　結(jié)果:MTT實驗結(jié)果顯示，在第24h，與對照組相比，15.5mM-和25.5mM-組的吸光度值均沒有顯著變化(P＞0.05);然而，35.5mM-組的吸光度值較對照組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在第72h，與對照組相比較，15.5mM-組的吸光度值有顯著升高，

8、差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);然而，25.5mM-和35.5mM-組的吸光度值較對照組顯著降低，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。此外，在每一時間點，使用LY294002處理過的四組細胞的吸光度值較對照組均顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　ALP實驗結(jié)果顯示，在第3d，與對照組相比較，15.5mM-組、25.5mM-組、35.5mM-組的吸光度值均無顯著變化，差異沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，然而，添

9、加LY294002處理的四組細胞的吸光度值較對照組均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在第7d，15.5mM-組表現(xiàn)出最高的吸光度值，且與對照組相比具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，然而，25.5 mM-組和35.5 mM-組的吸光度值較對照顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。此外，經(jīng)LY294002處理的四組細胞的吸光度值較對照組顯著降低(P＜0.05)，其中，15.5mM+組的吸光度值高于5.5 mM+組、25.

10、5mM+組和35.5 mM+組，且差異具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　茜素紅染色結(jié)果顯示，在第7d，15.5mM-組鈣結(jié)節(jié)的積分吸光度值顯著高于對照組及其他實驗組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，同時，25.5mM-組和35.5mM-組鈣結(jié)節(jié)的積分吸光度值也要高于對照組，且差異具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，此外，經(jīng)LY294002處理的四組細胞的鈣結(jié)節(jié)積分吸光度值較對照組均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);

11、在第14d，與對照組相比，15.5mM-組鈣結(jié)節(jié)的積分吸光度值要顯著增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，然而，25.5mM-組和35.5mM-組鈣結(jié)節(jié)的積分吸光度值與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)，同樣，經(jīng)LY294002處理的四組細胞的鈣結(jié)節(jié)積分吸光度值較對照組均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runt-related transcription factor2，RunX2)表達

12、結(jié)果顯示，在第3d，5.5mM+組的基因相對表達量顯著低于對照組，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其余各組的基因相對表達量與對照組相比沒有明顯差異(P＞0.05);在第7d，15.5mM-組的基因相對表達量較對照組明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，同時，15.5mM+組的基因相對表達量與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)，其余各組的基因相對表達量均較對照組顯著降低(P＜0.05)。
　　鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子(Ost

13、erix)表達結(jié)果顯示，在第3d，5.5mM+組的基因相對表達量顯著低于對照組，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，15.5mM-組的基因相對表達量顯著高于對照組，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其余各組的基因相對表達量與對照組相比沒有明顯差異(P＞0.05);在第7d，15.5mM-組及15.5mM+組的基因相對表達量較對照組均明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，同時，5.5mM+組的基因相對表達量與對照組相比明顯降

14、低，且有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其余各組的基因相對表達量與對照組相比沒有明顯差異(P＞0.05)。
　　骨橋蛋白(Osteoprotegerin，OPN)結(jié)果顯示，在第3d與7d兩個時間點各組的變化趨勢一致，15.5mM-組、25.5mM-組及15.5mM+組的基因相對表達量顯著高于照組，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，35.5mM+組的基因相對表達量與對照組相比顯著降低，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其余各組的

15、基因相對表達量與對照組相比沒有明顯差異(P＞0.05)。
　　骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)結(jié)果顯示，在第3d，15.5mM-組的基因相對表達量顯著高于對照組，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，5.5mM+組的基因相對表達量顯著低于對照組，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其余各組的基因相對表達量與對照組相比沒有明顯差異(P＞0.05);在第7d，15.5mM-組、25.5mM-組及25.5mM-組的基因相對表

16、達量較對照組明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，同時，5.5mM+組、25.5mM+組及35.5mM+組的的基因相對表達量顯著低于對照組，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，15.5mM+組的基因相對表達量與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。
　　蛋白免疫印跡(Western blot)檢測P-Akt的表達結(jié)果顯示，在第3d，15.5mM-組的P-AKT表達量顯著高于對照組，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，2

17、5.5mM-組的P-AKT的表達量較對照組無明顯變化(P＞0.05)，其余各組的P-AKT表達量均較對照組顯著降低(P＜0.05);在第7d，15.5mM-組和25.5mM-組的P-AKT表達量較對照組無顯著差異(P＞0.05)，其余各組的P-AKT表達量均較對照組顯著降低(P＜0.05)。
　　硬組織切片觀察結(jié)果顯示，術(shù)后30天，A組:骨沒有填滿種植體與骨組織之間的空腔;B組:在種植體與骨組織之間的空腔中，填滿了新形成的編織骨，

18、且骨與種植直接接觸，沒有纖維組織細胞的干擾;C組:和B組相比較，新形成的編織骨更加緊致規(guī)則，種植體表面的骨開始重建并出現(xiàn)類骨質(zhì)沉淀。術(shù)后60天，C組的種植體周圍包繞著非常致密的骨組織，可見骨細胞沉積在板層骨上，新舊骨組織之間可觀察到結(jié)合線;A組和B組的骨-種植體結(jié)合狀況與C組類似。
　　HE染色結(jié)果顯示:術(shù)后7天:三組均未見明顯的新生骨，并且有大量的炎性細胞浸潤;術(shù)后14天，對照組和實驗組均未見明顯的新生骨，可見較多活躍的破骨細胞

19、，C組的炎性細胞明顯少于A組和B組，且C組的松質(zhì)骨較其他兩組更為致密。A組和B組的破骨細胞數(shù)目在14天后達到峰值，C組在第7天達到峰值，并隨時間逐漸下降;但C組的平均破骨細胞數(shù)目較A組、B組沒有顯著差異，p＞0.05。
　　免疫組化染色觀察種植體周圍整合素α5β1及纖維連接蛋白的表達結(jié)果顯示，纖維連接蛋白及其受體主要在種植體周圍骨組織中及破骨細胞表面表達，而整合素α5β1則主要在成骨細胞表面表達。纖維連接蛋白及整合素α5β1在C組

20、中的表達要高于其他兩組。
　　整合素α5β1的光密度值表達顯示，在整個實驗過程中，C組種植體周圍骨組織中整合素α5β1的表達要顯著高于A組和B組(p=0.003)。在第7天，A組和B組的整合素α5β1表達量相同(p＞0.05)，但是，在第14天，B組的整合素α5β1表達量要顯著高于A組(p=0.027)，第30天以后，A組和B組的差異沒有統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。
　　纖維粘連蛋白的光密度值表達顯示，在整個實驗過程中，C組

21、種植體周圍骨組織中纖維粘連蛋白的光密度值表達顯著高于A組和B組(p=0.012)。在第7天、14天、30天，A組和B組的纖維粘連蛋白沒有統(tǒng)計學差異(p＞0.05)，但是，在第60天開始，B組的纖維粘連蛋白表達量要顯著高于A組(p=0.001)。
　　結(jié)論:1.適當?shù)母咛牵ㄈ?5.5mM）能促進MC3T3-E1細胞的增殖及成骨分化，過高的糖濃度（25.5 mM和35.5 mM）則起抑制作用;
　　2.PI3K/Akt信號通路在