中國(guó)人群中ADNFLE患者的CHRNA4突變及多態(tài)性研究.pdf

1、常染色體顯性遺傳夜間發(fā)作性額葉癲癇(autosomal dominant noctumal frontal lobe epilepsy，ADNFLE)是一種常染色體顯性單基因遺傳病，通常兒童期起病，可持續(xù)于成年期，發(fā)作與睡眠關(guān)系密切，其特點(diǎn)為夜發(fā)性、叢集性、短暫性運(yùn)動(dòng)性癲癇，常被誤診為睡眠障礙。ADNFLE一般依據(jù)臨床特點(diǎn)診斷，輔助檢查缺乏特異性指標(biāo)，發(fā)作間期腦電圖異常較為少見(jiàn)，頭顱CT、MRI也未發(fā)現(xiàn)特征性的腦結(jié)構(gòu)異常。正是由于缺乏特

2、異性診斷指標(biāo)，給診斷和鑒別診斷帶來(lái)較大困難，且頻繁的夜間發(fā)作，嚴(yán)重地威脅患兒的健康和生命安全。究其原因主要為ADNFLE的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。雖然近年來(lái)有學(xué)者通過(guò)對(duì)ADNFLE家系的研究在位于染色體20q、1q的編碼神經(jīng)元煙堿乙酰膽堿受體(nAChR)亞基(分別為α4和β2)的兩個(gè)基因(CHRNA4和CHRNB2)上發(fā)現(xiàn)異常，但存在一定的種族差異，且中國(guó)ADNFLE患者的基因異常尚未被發(fā)現(xiàn)。nAChR是一種離子通道受體，由α、β、γ、

3、6等4種異質(zhì)亞基組成的五聚體，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的nAChR主要為α2β4型。雖然已報(bào)道ADNFLE與CHRNA4和CHRNB2兩種基因突變有關(guān)，但至今研究較多且與ADNFLE關(guān)系較明確的致病基因仍為定位于20q13.2的CHRNA4基因。 有鑒于此，我們假設(shè)中國(guó)ADNFLE患者亦可能存在CHRNA4的異常。這種異?？赡茉斐善淠X神經(jīng)元上nAChR的結(jié)構(gòu)或功能變化，進(jìn)而導(dǎo)致ADNFLE起病。因此，本研究擬采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法對(duì)6個(gè)

4、家系及46例散發(fā)患者的CHRNA4基因的全部外顯子進(jìn)行突變篩查，尋找中國(guó)人群ADNFLE的致病基因，探索ADNFLE患者CHRNA4基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性(coding single nucleotide polymorphism，cSNP)的特征，闡明中國(guó)人群．ADNFLE發(fā)病的分子機(jī)制。 [對(duì)象和方法] 1.對(duì)象：臨床診斷為ADNFLE甩的家系6個(gè)，夜間發(fā)作額葉癲癇散發(fā)病例46例。 2.CHRNA4突變的

5、篩查： (1)每例樣本取200μl外周靜脈血液，提取基因組DNA。 (2)全部標(biāo)本運(yùn)用PCR方法特異性擴(kuò)增CHRNA4的1～6號(hào)外顯子片段。 (3)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，采用ABl3730測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用利用相應(yīng)進(jìn)行比對(duì)分析。 3.統(tǒng)計(jì)：用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P值小于0.05為差異有顯著性。 [結(jié)果] 1.本組ADNFLE家系及散發(fā)患者CHRNA4基因1～6號(hào)外顯

6、子片段均未發(fā)現(xiàn)基因突變(包括已報(bào)道的熱點(diǎn)突變)的存在，。 2.在第五號(hào)外顯子中發(fā)現(xiàn)四個(gè)堿基替換，909T→G、1440G→T、1458T→C及942C→T，均為同義替換。前三種突變?cè)?0例ADNFLE患者(包括家系和散發(fā)患者)和40例健康對(duì)照者均存在，942C→T僅在單個(gè)ADNFLE家系患者中發(fā)現(xiàn)。 [結(jié)論] 1.本實(shí)驗(yàn)成功地體外擴(kuò)增了CHRNA4基因的1～6外顯子，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，未發(fā)現(xiàn)基因突變的存在，

7、包括已報(bào)道的熱點(diǎn)突變(S252F、S256L263insL、T265I)或其他位置均未見(jiàn)突變。提示CHRNA4很可能不是中國(guó)南粵地區(qū)ADNFLE患者的主要致病基因。進(jìn)一步證實(shí)了ADNFLE具有明顯的遺傳異質(zhì)性。 2.在CHRNA4的第五號(hào)外顯子上發(fā)現(xiàn)4種同義堿基替換(909T→C、1440G→T、1458T→C和942C→T)，前三種在本研究全部ADNFLE患者(包括家系和散發(fā))及健康對(duì)照者中均存在，為基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性。