GCPⅡ基因剔除對(duì)顱腦外傷后神經(jīng)元的保護(hù)作用以及對(duì)外傷性腦水腫的影響.pdf

1、研究背景：
　　腦外傷是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中最常見(jiàn)的損傷，對(duì)人類(lèi)的生命有著嚴(yán)重的威脅，其致殘率、患病率和死亡率居高不下，并且每年都有上升的趨勢(shì)。我國(guó)人口基數(shù)大人口增長(zhǎng)快，無(wú)論患病還是發(fā)病數(shù)量都是驚人。早前報(bào)道全球每年有近1000萬(wàn)人發(fā)生腦外傷，其中有580萬(wàn)人因腦外傷而死亡，占到世界死亡人口的10％，根據(jù)預(yù)測(cè)到2020年腦外傷將成為全球第三大類(lèi)疾病。我國(guó)在研究腦外傷方面，主要側(cè)重在臨床方面，如腦外傷的救治、預(yù)后以及康復(fù)等方面，涉及到顱腦

2、外傷的急救，各種治療方式的優(yōu)缺點(diǎn)，治療后的認(rèn)知功能障礙護(hù)理、后遺癥等等，然而對(duì)腦外傷的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的研究相對(duì)較少。腦外傷引起的神經(jīng)損傷主要為直接損傷和繼發(fā)性的間接腦損傷，直接或間接引起的神經(jīng)元的凋亡以及外傷后腦水腫引起的繼發(fā)性損害。
　　大腦是動(dòng)物和人類(lèi)的一個(gè)重要的組織器官，大腦皮層包括大量的神經(jīng)元，是控制行動(dòng)、語(yǔ)言、思維活動(dòng)的重要區(qū)域。科學(xué)家在人類(lèi)和動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，腦外傷后大腦皮層的損傷，可以引起嚴(yán)重的行為、語(yǔ)言、思維活動(dòng)的

3、損害，嚴(yán)重的影響了患者的病情和預(yù)后，目前尚缺乏有效的治療和保護(hù)措施，尤其是內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制。因此對(duì)腦外傷后大腦的保護(hù)機(jī)制以及措施的研究成為國(guó)際和國(guó)內(nèi)近幾年研究的熱門(mén)話題。
　　顱腦損傷后，遭受打擊的神經(jīng)細(xì)胞會(huì)釋放以谷氨酸為主的興奮型神經(jīng)遞質(zhì)，激活谷氨酸受體并且直接或者間接的啟動(dòng)電壓依賴(lài)性Ca2+通道，Ca2+的大量?jī)?nèi)流使細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載。Ca2+與鈣離子調(diào)節(jié)蛋白相結(jié)合，進(jìn)一步的反應(yīng)作用而使得皮層神經(jīng)元受到損害。另一方面，產(chǎn)生大量

4、超氧陰離子產(chǎn)生，進(jìn)一步反應(yīng)生成過(guò)氧化亞硝酸鹽離子或亞硝酸根離子，進(jìn)而進(jìn)一步抑制能量代謝。能量代謝的抑制使細(xì)胞內(nèi)膜損傷和自由基增加，致使細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹等多種因素引起細(xì)胞的凋亡。近年來(lái)我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)在腦外傷腦損傷后釋放大量谷氨酸的同時(shí)也釋放著一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的肽類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì) N-乙酰天冬氨酸谷氨酸（N-acetylaspartylglutamate，NAAG），NAAG對(duì)外傷后谷氨酸的釋放具有極強(qiáng)的抑制作用。NAAG肽酶位于膠質(zhì)細(xì)胞上

5、，然而NAAG釋放后很快被NAAG肽酶水解成N-乙酰天冬氨酸（N-acetylaspartate，NAA）及谷氨酸，因此而失去了神經(jīng)保護(hù)作用。由此NAAG肽酶的活性被抑制，從而抑制NAAG的降解，提高突觸間隙NAAG的濃度，進(jìn)而減少谷氨酸釋放在病理進(jìn)程中的進(jìn)一步損害。NAAG肽酶抑制劑在大量的試驗(yàn)中被成功合成并在谷氨酸過(guò)度釋放的谷氨酸毒性模型中進(jìn)一步證實(shí)了其保護(hù)作用，然抑制劑易受環(huán)境以及自身藥物濃度等方面的影響而影響其發(fā)揮作用的穩(wěn)定度，

6、NAAG肽酶基因剔除后能更穩(wěn)定的消除NAAG肽酶的表達(dá)從而起到神經(jīng)保護(hù)作用，目前在基因?qū)用娴难芯磕壳磅r為少見(jiàn)。在本試驗(yàn)中，應(yīng)用控制性腦皮質(zhì)撞擊儀，對(duì)前期成功建立起來(lái)的GCPⅡ基因剔除模型小鼠進(jìn)行打擊制作中度顱腦損傷模型的研究，通過(guò)一系列檢測(cè)指標(biāo)，觀察大腦皮層損傷以及繼發(fā)性變化，從而進(jìn)一步認(rèn)證GCPⅡ基因剔除對(duì)小鼠腦外傷后腦組織的保護(hù)作用。
　　第一部分小鼠GCPⅡ基因剔除對(duì)腦外傷后神經(jīng)元的影響的研究
　　目的：通過(guò)對(duì)小鼠中度

7、顱腦損傷模型的建立，對(duì)小鼠大腦損傷周?chē)鷧^(qū)神經(jīng)元的凋亡情況進(jìn)行研究，探討GCPⅡ基因剔除對(duì)腦外傷后神經(jīng)元的影響。
　　方法：雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)20只,隨機(jī)分成兩組（C57BL/6J小鼠假手術(shù)組10只，C57BL/6J小鼠顱腦損傷組10只);雄性GCPⅡ基因剔除小鼠20只，隨機(jī)分成兩組（GCPⅡ基因剔除小鼠假手術(shù)10只，GCPⅡ基因剔除小鼠顱腦損傷組10只）(均為8-12W,體重20-25g，均由上海南方模式生物研究中心提供

8、)。取0.6%戊巴比妥溶液，80mg/kg對(duì)小鼠行腹腔注射麻醉；將小鼠固定于腦立體定向儀（Stoeling Inc.USA);并在人字縫和矢狀縫的交界處消毒。作正中切口，鑷子分開(kāi)頭皮并用骨膜剝離子剝離骨膜；電鉆在人字縫之間和右側(cè)冠狀縫、中線旁3mm處進(jìn)行顱骨鉆孔，做出直徑為3mm的骨窗并暴露完整硬腦膜；應(yīng)用PinPointTMPCI3000精細(xì)顱骨撞擊儀（Hatteras Instruments Inc. USA）設(shè)定打擊參數(shù)（打擊深度

9、1.0mm;打擊時(shí)間均為80ms；打擊速度均為1.5m/s），以直徑3mm的打擊頭行精確撞擊小鼠腦皮質(zhì)。還回骨瓣，頭皮進(jìn)行縫合。假手術(shù)組在麻醉后暴露骨窗，對(duì)腦皮質(zhì)不打擊，還納骨瓣并縫合頭皮。傷后24h對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，斷頭、取腦、切片后行免疫熒光染色，通過(guò)對(duì)損傷周?chē)鷧^(qū)域凋亡神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)，觀察不同組別神經(jīng)元凋亡的變化。
　　結(jié)果：神經(jīng)功能評(píng)分的結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腦外傷后 GCPⅡ基因剔除小鼠在神經(jīng)功能綜合評(píng)分方面相對(duì)C5

10、7BL/6J小鼠明顯的改善和提高，外傷后 GCPⅡ基因剔除小鼠與C57BL/6J小鼠神經(jīng)功能評(píng)分差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），GCPⅡ基因剔除小鼠較 C57BL/6J小鼠外傷后神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯減少，兩組數(shù)值差距具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。
　　結(jié)論：通過(guò)研究我們發(fā)現(xiàn)小鼠 GCPⅡ基因敲除后，腦組織損傷周?chē)鷧^(qū)域神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少，小鼠神經(jīng)功能明顯改善。
　　第二部分小鼠的GCPⅡ基因剔除對(duì)腦外傷后腦水腫的影響

11、的研究
　　目的：研究普通小鼠和GCPⅡ基因剔除后小鼠腦外傷后腦水腫以及神經(jīng)功能的變化,探討并研究GCPⅡ基因剔除后對(duì)腦外傷后腦水腫的影響。
　　方法：雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)20只,隨機(jī)分成兩組（C57BL/6J小鼠假手術(shù)組10只，C57BL/6J小鼠顱腦損傷組10只);雄性GCPⅡ基因剔除小鼠20只，隨機(jī)分成兩組（GCPⅡ基因剔除小鼠假手術(shù)10只，GCPⅡ基因剔除小鼠顱腦損傷組10只）(均為8-12W,體重20-25

12、g，均由上海南方模式生物研究中心提供)。應(yīng)用PinPointTMPCI3000精細(xì)顱腦撞擊儀，設(shè)定參數(shù)(打擊深度為1.0mm;打擊時(shí)間為80ms,打擊的速度為1.5m/s)，精確撞擊小鼠腦皮質(zhì)。小鼠顱腦外傷后24h，進(jìn)行干濕重比較法測(cè)定腦組織含水量，MRI掃描并測(cè)量計(jì)算損傷區(qū)域水腫體積以及T2WI序列的信號(hào)強(qiáng)度，行大腦外傷周?chē)鷧^(qū)域免疫熒光染色，檢測(cè) Western Blot檢測(cè)AQP4蛋白的表達(dá)，檢測(cè)血腦屏障破壞程度。
　　結(jié)果：

13、GCPⅡ基因剔除小鼠較C57BL/6J小鼠外傷后神經(jīng)功能明顯善(p＜0.05）;GCPⅡ基因剔除小鼠腦組織含水量、水腫體積以及外傷區(qū)域T2WI信號(hào)強(qiáng)度較C57BL/6J小鼠組降低（p＜0.05）；GCPⅡ基因剔除小鼠明顯減少損傷側(cè)伊文思藍(lán)含量（p＜0.05）；GCPⅡ基因剔除小鼠免疫熒光檢測(cè)到腦組織損傷區(qū)域周?chē)切文z質(zhì)細(xì)胞AQP4蛋白含量明顯下降；Western Blot檢測(cè)AQP4蛋白的表達(dá)明顯下降（p＜0.05）。
　　結(jié)論：