蘭州地區(qū)急性呼吸道感染患兒HRV-HEV的臨床和分子流行病學(xué)研究.pdf

1、目的：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及RT-PCR方法對(duì)蘭州地區(qū)急性呼吸道感染患兒的鼻咽抽吸物進(jìn)行HRV/HEV的檢測(cè)及分型，初步掌握HRV/HEV在蘭州地區(qū)急性呼吸道感染兒童中的流行特征；探討不同HRV/HEV基因型與兒童急性呼吸道感染疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系，掌握其流行特點(diǎn)及規(guī)律，揭示和闡明了蘭州地區(qū)兒童急性呼吸道感染的病因構(gòu)成及HRV/HEV臨床及流行病學(xué)特點(diǎn)，并運(yùn)用單引物擴(kuò)增技術(shù)DNaseISISPA-PCR擴(kuò)增獲得了5株蘭州鼻病毒C群的全基

2、因組，為蘭州地區(qū)兒童呼吸道感染的防治及進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 研究對(duì)象及方法：
　　 1.收集蘭州地區(qū)2007年12月至2009年11月間，蘭州大學(xué)第一醫(yī)院兒科因急性呼吸道感染而就診或住院的兒童(年齡＜18歲)的鼻咽抽吸物(NPAs)和咽拭子標(biāo)本共計(jì)772份，其中2007年12月-2008年11月255份，2008年12月-2009年11月517份。
　　 2.收集鼻咽抽吸物和咽拭子標(biāo)本在登記相關(guān)標(biāo)本采集

3、表后，低溫運(yùn)送至中國(guó)CDC病毒所。呼吸道標(biāo)本經(jīng)提取核酸后通過(guò)Real-time RT-PCR檢測(cè)HRV/HEV。同時(shí)每份標(biāo)本采用PCR及RT-PCR方法檢測(cè)了HRSV、IFV(A和B型)、PIV(1、2、3)、HMPV、HCoV(HKU1和NL63型)、AdV、HBoV、WUPyV、KIPyV，并進(jìn)行了序列測(cè)定。隨機(jī)選取一例HRV陽(yáng)性標(biāo)本的Real-time RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄成RNA標(biāo)準(zhǔn)品，梯度稀釋后用以對(duì)HRV核酸濃度進(jìn)行定

4、量。使用基于5-UTR普通RT-PCR和VP4/VP2基因連接區(qū)的巢式RT-PCR兩個(gè)區(qū)段，對(duì)Real-time RT-PCR陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，所得測(cè)序結(jié)果與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)中心(NCBI)Genebank中的序列進(jìn)行BLAST比較分析。采用MEGA4.0軟件對(duì)序列進(jìn)行分析，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
　　 3.選取蘭州大學(xué)第一醫(yī)院兒科因急性呼吸道感染而就診或住院的，經(jīng)熒光定量PCR和普通RT-PCR檢測(cè)并分型為

5、鼻病毒C群的陽(yáng)性的兒童的鼻咽抽吸物標(biāo)本，經(jīng)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)中心(NCBI)Genebank中進(jìn)行BLAST比較分析及MEGA4.0軟件對(duì)序列進(jìn)行分析，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)后，選取與Genebank中的已發(fā)表的病毒株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)的毒株進(jìn)行Dnase I-SISPA-PCR擴(kuò)增，大量隨機(jī)挑取克隆，并測(cè)序后，獲得病毒的全基因組。
　　 結(jié)果：在連續(xù)收集的兩年的鼻咽抽吸物標(biāo)本中，共檢出HRV/HEV陽(yáng)性標(biāo)本205例，總檢出率為26.55％

6、。其中HRV檢出192例，檢出率為24.87％(192/772)；HEV檢出13例，檢出率為1.68％(13/772)。在HRV陽(yáng)性的192例陽(yáng)性標(biāo)本中，HRV A型共發(fā)現(xiàn)112例，檢出率為14.6％(112/772)占所有HRV陽(yáng)性標(biāo)本的58.3％；HRV B型，14例檢出率為1.8％(14/772)占所有HRV陽(yáng)性標(biāo)本的7.29％；HRV C型，66例，檢出率為8.5％(66/772)，占所有HRV陽(yáng)性標(biāo)本的34.4％。其中，男性患

7、兒的檢出率為27.2％(133/488)，女性患兒的檢出率為25.4％(72/284)，男女感染率之比為1.85：1，男女的感染率無(wú)性別差異(P=0.564＞0.05)。感染患兒的年齡在6天-13歲10月之間，中位年齡為10月。其中1歲以內(nèi)患兒115人，檢出率為30.1％(115/382)；1-3歲患兒50人，檢出率為16.9％(50/295)；3-5歲的患兒27人，檢出率為22.5％(27/120)；大于5歲的患兒13人，檢出率為17

8、.3％(13/75)，分別占了HRV/HEV感染人數(shù)的56.1％，24.4％，13.2％和6.3％。HRV/HEV感染患兒最多的診斷為急性支氣管肺炎、急性喘息性支氣管肺炎、上呼吸道感染和急性支氣管炎。在檢測(cè)的所有陽(yáng)性標(biāo)本中36.6％(75/205)的HRV/HEV感染患兒為單獨(dú)感染；63.4％(130/205)的HRV/HEV感染患兒為混合感染，男女的混合感染率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.92＞0.05)。在混合感染的RNA病毒中，43.

9、1％(56/130)的患兒混合感染人合胞病毒(HRSV)；31.5％(41/130)的患兒混合感染人流感病毒病毒A型(IFV A)；27.7％(36/130)的患兒混合感染人副流感病毒3型(PIV3)；19.2％(25/130)的患兒混合感染人流感病毒B型(IFV B)；0.3％(4/130)的患兒混合感染的人冠狀病毒NL63型(HcoV-NL63)；0.2％(4/130)的患兒混合人副流感病毒2型(PIV2)；0.2％(3/130)的

10、患兒混合感染感染人偏肺病毒(hMPV)，在混合感染的DNA病毒方面，13.9％(18/130)的患兒混合感染人博卡病毒(HBoV)：8.5％(11/130)的患兒混合感染人多瘤病毒W(wǎng)U型(WUPyV)；8.5％(11/130)的患兒混合感染人多瘤病毒KI型(KIPyV)；0.4％(5/130)的患兒混合感染人腺病毒(AdV)。人合胞病毒(HRSV)、人流感病毒(IFV)、人副流感病毒(PIV)和人博卡病毒(HBoV)為最常見(jiàn)的混合感染病

11、毒。在合并的細(xì)菌感染方面，117分陽(yáng)性標(biāo)本做了細(xì)菌培養(yǎng)鑒定，其中70例為正常菌群或無(wú)菌生長(zhǎng)；47例合并有細(xì)菌感染，最常見(jiàn)的合并感染的病原菌為肺炎克雷伯桿菌9例；大腸桿菌7例；肺炎鏈球菌7例；金黃色葡萄球菌7例；流感嗜血桿菌5例；副流感嗜血桿菌4例；陰溝桿菌3例。5’-UTR區(qū)段和VP4/VP2基因進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，所有的標(biāo)本均能很好的分型，分別為HRV A、HRV B、HRV C和HEV。對(duì)HRV A與HRV C組間臨床癥狀進(jìn)行比較，差別無(wú)

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.HRV/HEV的檢出率較高，在兒童呼吸道感染中占有重要地位，是繼呼吸道合胞病毒病毒后的第二位致小兒呼吸道感染的病毒性致病原。
　　 2.在臨床特點(diǎn)方面的比較HRV C感染與HRV A感染，無(wú)明顯差別。
　　 3.在蘭州地區(qū)擴(kuò)增獲得的5株鼻病毒C群的全基因組，其中有4株與已有的HRV C全基因組的核苷酸同源性，可認(rèn)為是HRVC的亞型。