遺傳多態(tài)性、microRNA與肺癌、焦爐工氧化應(yīng)激和遺傳損傷的關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。大量研究表明,肺癌是由遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。研究者們能夠通過全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome wide association studies,GWAS)較為全面了解個體的遺傳因素。目前肺癌GWAS研究已經(jīng)在不同人種(包括中國漢族人群)中報道了多個肺癌易感性位點。然而,所確定的大多數(shù)易感性位點對肺癌發(fā)生的作用較小,僅能解釋部分的肺癌發(fā)生,因此還需要繼續(xù)尋找新的肺癌易感性位點?；蛐吞钛a

2、能夠?qū)ξ捶中偷倪z傳變異進行預(yù)測,基于基因型填補的關(guān)聯(lián)性研究有利于發(fā)現(xiàn)新的遺傳易感性位點。細胞周期調(diào)節(jié)、凋亡、氧化應(yīng)激和炎性免疫反應(yīng)應(yīng)答通路在吸煙所致肺癌中發(fā)揮了重要作用。然而目前仍不太清楚這些通路上的遺傳變異肺癌易感性的關(guān)聯(lián)。為此我們在第一部分中采用基于基因型填補的關(guān)聯(lián)性研究策略,全面探索細胞周期調(diào)節(jié)、凋亡、氧化應(yīng)激和炎性免疫應(yīng)答通路的遺傳多態(tài)性與肺癌易感性之間的關(guān)聯(lián)。
　　大量研究表明,除遺傳因素外,肺癌發(fā)生與環(huán)境因素密切相關(guān)。

3、環(huán)境因素的暴露能夠改變機體的表觀基因組,進而改變基因的表達,影響疾病的發(fā)生發(fā)展。微小RNA(microRNA,miRNA)是表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)的主要機制之一。眾多研究表明,香煙煙霧的暴露能夠改變機體的miRNA表達水平。然而,PAHs作為香煙煙霧中的一類重要的致癌物,目前很少有流行病學(xué)研究表明PAHs暴露能否影響miRNA表達水平。為此我們以肺癌高發(fā)性的、PAHs高暴露的職業(yè)性人群——焦爐工為研究對象,在第二部分的第一節(jié)中詳細探討了PAHs

4、暴露對miRNA表達的影響。
　　氧化應(yīng)激和遺傳損傷是PAHs誘發(fā)肺癌的重要機制。PAHs在代謝過程中能產(chǎn)生大量活性自由基(reactive oxygen species,ROS)。ROS能攻擊生物大分子,從而造成組織細胞損傷,是誘發(fā)腫瘤發(fā)生的重要起因。此外,PAHs經(jīng)代謝后可生成二羥基環(huán)氧化物,可與DNA分子共價結(jié)合形成PAHs-DNA加合物,進而引起DNA鏈斷裂、基因組不穩(wěn)定和染色體損傷等遺傳損傷。這些遺傳損傷是腫瘤發(fā)生的早期

5、生物學(xué)事件。miRNA可以通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和DNA損傷應(yīng)答中的重要靶基因,進而介導(dǎo)機體對氧化應(yīng)激和遺傳損傷的應(yīng)答反應(yīng)。然而目前尚無流行病學(xué)研究表明miRNA是否與PAHs引起的氧化應(yīng)激和遺傳損傷相關(guān)。為此,我們在第二部分的第二、三節(jié)中以焦爐工為研究對象,進一步探討了PAHs相關(guān)性miRNA與氧化應(yīng)激、遺傳損傷的關(guān)聯(lián)。
　　第一部分：重要通路上的遺傳多態(tài)性及其與吸煙的交互作用對肺癌易感性的影響
　　細胞周期調(diào)節(jié)、凋亡、氧化應(yīng)激

6、和炎性免疫應(yīng)答在吸煙導(dǎo)致肺癌中發(fā)揮了重要作用。然而目前仍不太清楚這些通路上的遺傳多態(tài)性與肺癌易感性之間的關(guān)聯(lián)。中國漢族人群肺癌GWAS已經(jīng)確定了多個肺癌易感性遺傳位點,為了繼續(xù)尋找新的肺癌易感性位點,我們采用基于基因型填補的關(guān)聯(lián)性研究,探討細胞周期調(diào)節(jié)、凋亡、氧化應(yīng)激和炎性免疫應(yīng)答信號通路上的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)對肺癌易感性的影響。我們首先從中國漢族人群肺癌GWAS基

7、因型填補后的數(shù)據(jù)庫(2331例肺癌病例與3077例對照)中,選擇了24042個相關(guān)通路上的SNPs,評價它們與肺癌易感性的關(guān)聯(lián),隨后在另外兩個人群中進行了驗證(共4133例肺癌病例與4522例對照)。
　　兩個SNPs(rs2282987與rs2706748)被成功驗證出來。當我們合并三個階段的結(jié)果后發(fā)現(xiàn),rs2282987與肺癌易感性相關(guān)(OR=1.18,Padd=2.27×10-9)。與rs2282987GG攜帶者相比,rs2

8、282987CC攜帶者的肺癌易感性顯著增高(OR=1.37,Phomo=1.10×10-6)。rs2706748與肺癌易感性之間的正相關(guān)關(guān)系(OR=1.17,Padd=5.10×10-6)雖然未達到基于通路的顯著性閾值(Padd>2.0×10-6),但由于它在三個階段中的Padd均符合各個階段的要求(GWAS階段Padd=9.65×10-5;I期驗證Padd=3.26×10-2;II期驗證Padd=4.49×10-2),因此也納入了后續(xù)

9、的分析中。交互作用分析發(fā)現(xiàn),在年齡為51-60歲之間的人群中,rs2282987和rs2706748與吸煙狀態(tài)(rs2282987:Pinteraction=1.04×10-2;rs2706748:Pinteraction=3.03×10-2)和吸煙劑量(rs2282987:Pinteraction=1.21×10-2;rs2706748:Pinteraction=5.21×10-2)之間存在交互作用。遺傳多態(tài)性與吸煙對肺癌易感性的聯(lián)合

10、效應(yīng)分析表明,攜帶兩個SNPs的危險等位基因的重度吸煙者的肺癌風險最高。
　　在本部分研究中我們最終確定了CDK6和SH3RF1基因上的兩個肺癌易感性位點,進一步證明細胞周期和凋亡是肺癌發(fā)生的重要病因?qū)W機制。此外,我們發(fā)現(xiàn)在年齡為51-60歲的人群中,遺傳多態(tài)性能夠與吸煙交互作用,共同影響肺癌易感性,進一步強調(diào)了基因-環(huán)境交互作用是肺癌發(fā)生的重要機制。此外,聯(lián)合效應(yīng)分析有助于確定高危人群,以便進行肺癌的早期預(yù)防和篩查。
　　

11、第二部分：血漿中多環(huán)芳烴相關(guān)性microRNA及其與焦爐工氧化應(yīng)激和遺傳損傷的關(guān)聯(lián)性
　　第一節(jié)：焦爐工血漿microRNA表達譜情況及特征性microRNA的驗證
　　暴露于環(huán)境因素后,機體的miRNA表達水平可發(fā)生改變。由于血漿miRNA是生理狀態(tài)和疾病狀態(tài)的穩(wěn)定標記物,因此我們將采取兩階段研究策略,初步探討職業(yè)性PAHs暴露對血漿miRNA表達情況的影響。我們以391名男性健康焦爐工作為研究對象,以尿羥基多環(huán)芳烴(mo

12、nohydroxy polycyclic aromatic hydrocarbons,OH-PAHs)和血漿BPDE-白蛋白加合物作為PAHs內(nèi)暴露指標。在發(fā)現(xiàn)階段,我們根據(jù)焦爐工工作環(huán)境中PAHs的濃度水平,將工人分為對照組和暴露組,分別從兩組中各選擇了20名工人,采用Solexa測序法檢測兩組混合血漿的miRNA表達譜情況。在驗證階段,我們采用定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(quantitative reverse transcriptase p

13、olymerase chain reaction,qRT-PCR)驗證了8個差異表達且可能相關(guān)的miRNA,采用多元線性回歸,評價PAHs內(nèi)暴露水平與miRNA表達量之間的劑量反應(yīng)關(guān)系。
　　發(fā)現(xiàn)階段中,在暴露篩查組中表達水平較低的miRNA中,有68個miRNA的表達水平在兩組間存在五倍以上的差異;而在暴露篩查組中表達水平較高的miRNA中,僅有三個miRNA在兩組間存在兩倍以上的差異。我們選擇了8個miRNA進行驗證,最終發(fā)現(xiàn)

14、miR-24-3p、miR-27a-3p、miR-142-5p、miR-28-5p和miR-150-5p與PAHs內(nèi)暴露水平之間的關(guān)聯(lián)與發(fā)現(xiàn)階段的的表達趨勢具有一致性。miR-24-3p、miR-27a-3p和miR-142-5p的表達水平與4-OHPHE濃度呈負相關(guān)關(guān)系(βstd<-0.115,P<0.030);miR-24-3p與miR-28-5p的表達水平與血漿BPDE-白蛋白加合物濃度呈負相關(guān)關(guān)系(βstd<-0.165,P≤0

15、.004)。mR-150-5p是發(fā)現(xiàn)階段在暴露篩查組中表達量較高的miRNA,經(jīng)qRT-PCR驗證后,mR-150-5p的表達水平與1-OHNAP、2-OHNAP、2-OHPHE和ΣOH-PAHs的濃度呈正相關(guān)關(guān)系(βstd>0.120,P<0.030)。功能富集分析顯示,這五個miRNA的靶基因主要參與外源性刺激的應(yīng)答反應(yīng)、酶活性調(diào)節(jié)以及代謝過程等。
　　本節(jié)研究首次探討了PAHs暴露水平對miRNA表達譜的影響。發(fā)現(xiàn)階段的結(jié)果

16、表明,PAHs不同暴露組的miRNA表達譜存在差異,且大部分miRNA在暴露組中表達下調(diào);驗證階段最終確定了四個與PAHs暴露呈負相關(guān)關(guān)系的miRNA和一個與PAHs暴露呈正相關(guān)關(guān)系的miRNA,這些miRNA可能參與了外源性刺激的應(yīng)答反應(yīng)、酶活性調(diào)節(jié)以及代謝過程。該部分研究結(jié)果提示PAHs暴露可能會影響miRNA的表達,從而來介導(dǎo)其有害效應(yīng)。
　　第二節(jié)：多環(huán)芳烴相關(guān)性microRNA與焦爐工氧化應(yīng)激的關(guān)聯(lián)性
　　8-羥基

17、脫氧鳥苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)與8-異前列腺素(8-isoprostane,8-iso-PG)可分別用來評價氧化性DNA損傷和脂質(zhì)過氧化水平。miRNA可以通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激中的重要靶基因,進而介導(dǎo)機體的氧化應(yīng)激應(yīng)答反應(yīng)。為此我們以第一節(jié)驗證階段的365名工人為研究對象,檢測了尿8-OHdG和8-iso-PG的濃度,采用多元線性回歸分析,評價了PAHs相關(guān)性miRNA與8-OHdG和8-i

18、so-PG之間的劑量反應(yīng)關(guān)系。
　　對于8-OHdG而言,這五個miRNA與8-OHdG的關(guān)聯(lián)性在總?cè)巳褐芯鶡o統(tǒng)計學(xué)意義。分層分析后發(fā)現(xiàn),僅miR-142-5p與8-OHdG的正相關(guān)關(guān)聯(lián)在非吸煙者中具有臨界統(tǒng)計學(xué)意義(βstd=0.194,P=0.045)。對于尿8-iso-PG而言,miR-24-3p和miR-150-5p與8-iso-PG在總?cè)巳褐谐守撓嚓P(guān)關(guān)聯(lián)(βstd=-0.094,P<0.020),但均未達到Bonferr

19、oni多重校正的P值要求(P>0.010)。分層分析后發(fā)現(xiàn),miR-24-3p、miR-142-5p和miR-28-5p與8-iso-PG在非吸煙者中呈顯著的負相關(guān)關(guān)聯(lián)(βstd<-0.185,P≤0.010),且經(jīng)Bonferroni多重校正后,仍具有統(tǒng)計學(xué)意義,其中miR-28-5p與8-iso-PG的關(guān)聯(lián)性最強(βstd=-0.234)。
　　本節(jié)研究我們發(fā)現(xiàn),miRNA在總?cè)巳褐信c8-OHdG無相關(guān)性,而與8-iso-PG

20、呈一定的負相關(guān)關(guān)聯(lián),在非吸煙者中這種負相關(guān)關(guān)聯(lián)更加明顯,表明miRNA可能在非吸煙者中影響了PAHs引起的脂質(zhì)過氧化水平。
　　第三節(jié)：多環(huán)芳烴相關(guān)性microRNA與焦爐工遺傳損傷的關(guān)聯(lián)性
　　PAHs-DNA加合物可誘發(fā)DNA鏈斷裂、基因組不穩(wěn)定和染色體損傷。研究表明,miRNA介導(dǎo)了細胞對致癌物引起的DNA損傷的應(yīng)答反應(yīng)。為此我們以第一節(jié)驗證階段的365名工人為研究對象,檢測了工人淋巴細胞的DNA鏈斷裂和染色體損傷情況

21、,采用多元線性回歸和多元Poisson回歸分析,評價PAHs相關(guān)性miRNA與DNA鏈斷裂水平和染色體損傷之間的劑量反應(yīng)關(guān)系。
　　對于DNA鏈斷裂指標而言,在總?cè)巳褐?miR-142-5p與TailDNA％和TM存在正相關(guān)性(βstd>0.110,P≤0.010),經(jīng)Bonferroni多重校正后仍具有統(tǒng)計學(xué)意義。分層分析后發(fā)現(xiàn),在吸煙者中,miR-142-5p與TailDNA%呈正相關(guān)關(guān)系(βstd=0.125,P=0.006

22、),經(jīng)Bonferroni校正后仍具有統(tǒng)計學(xué)意義。對于染色體損傷指標而言,在總?cè)巳褐?這五個PAHs相關(guān)性miRNA與微核率的正相關(guān)關(guān)聯(lián)均具有統(tǒng)計學(xué)意義(FR>1.090,P≤0.002),且經(jīng)Bonferroni校正后仍具有統(tǒng)計學(xué)意義,其中miR-24-3p與微核率的關(guān)聯(lián)程度最強(FR=1.152)。分層分析后發(fā)現(xiàn),在吸煙者,miR-24-3p、miR-27a-3p、miR-28-5p和miR-150-5p均與與微核率呈正相關(guān)關(guān)聯(lián)(F

23、R>1.095,P≤0.005),且經(jīng)Bonferroni校正后仍具有統(tǒng)計學(xué)意義,其中miR-24-3p與微核率的關(guān)聯(lián)程度最強(FR=1.190);在年齡為41-60歲之間的工人中,miR-24-3p和miR-28-5p與微核率之間具有正相關(guān)關(guān)聯(lián)(FR>1.165,P<2.0×10-4),且經(jīng)Bonferroni校正后仍具有統(tǒng)計學(xué)意義,其中miR-24-3p與微核率的關(guān)聯(lián)程度最強(FR=1.174)。
　　本節(jié)結(jié)果表明,miRNA

24、可能影響了PAHs所致的遺傳損傷水平,尤其是染色體損傷,而miRNA對染色體損傷的影響在吸煙者和年齡為41-60歲之間的工人體內(nèi)更加顯著。
　　綜上所述,本研究探索了遺傳多態(tài)性、miRNA與肺癌易感性及PAHs所致早期健康損傷的關(guān)聯(lián)。我們在第一部分首先探索了四大重要通路上的遺傳多態(tài)性及其與吸煙的交互作用對肺癌易感性的影響。新發(fā)現(xiàn)了CDK6和SH3RF1基因上的兩個肺癌易感性位點,進一步證明細胞周期和凋亡是肺癌發(fā)生的重要病因?qū)W機制。

25、我們也發(fā)現(xiàn)在年齡為51-60歲的人群中,遺傳多態(tài)性能夠與吸煙交互作用,共同影響肺癌易感性,強調(diào)了基因-環(huán)境交互作用在肺癌發(fā)生中的重要作用。隨后為了研究表觀遺傳因素在環(huán)境有害因素致肺癌中的作用,我們以廣泛存在的PAHs為環(huán)境因素的代表,以PAHs高暴露的焦爐工為研究對象,采用兩階段研究策略首次探討了職業(yè)性PAHs暴露對miRNA表達的影響,發(fā)現(xiàn)不同PAHs暴露組間miRNA的表達譜情況存在差異,我們最終確定了五個PAHs相關(guān)性miRNA,