新型肝素-紫杉醇藥物輸送系統(tǒng)的制備及生物學(xué)性能研究.pdf

1、抗癌藥物紫杉醇其抗癌機(jī)理獨(dú)特,對卵巢癌、乳腺癌、肺癌和頭頸部癌均有良好的效果,是治療晚期卵巢癌的一線藥物之一。但由于其水溶性差,而其助溶劑易產(chǎn)生嚴(yán)重毒副作用,大大限制了其臨床應(yīng)用,為此開發(fā)具有良好水溶性的新型載藥系統(tǒng)受到了廣泛關(guān)注。
　　 近年來,生物大分子由于其良好的生物相容性、生物降解性,在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,特別是生物大分子在腫瘤組織中具有提高滲透和滯留作用(EPR)的特點(diǎn),將生物大分子作為載體與抗癌藥物結(jié)合,形成新的藥物輸

2、送系統(tǒng),可以改善藥物水溶性、控制藥物釋放速度、延長小分子藥物在體內(nèi)的循環(huán)周期,提高藥物利用率、增加藥物穩(wěn)定性和降低毒副作用等,這種藥物系統(tǒng)成為研究熱點(diǎn),具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 肝素是一種天然生物大分子,廣泛地存在于動(dòng)物組織和器官中,具有良好的水溶性、生物相容性和生物降解性,并且具有多種生物學(xué)功能。由于以上優(yōu)點(diǎn),本論文選用肝素作為藥物載體與抗癌藥物紫杉醇結(jié)合,設(shè)計(jì)新型的藥物體系。
　　 本論文進(jìn)行了深入性的研究工作,首

3、先設(shè)計(jì)、制備一種直接化學(xué)鍵連接的三元化肝素衍生物模擬應(yīng)用于抗癌藥物輸送系統(tǒng)。同時(shí)利用該模型反應(yīng)過程,分別制備出以直接化學(xué)鍵結(jié)合的肝素-紫杉醇藥物輸送系統(tǒng)(HD1),以及用氨基酸為連接臂的肝素-紫杉醇藥物系統(tǒng)(HD2),并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出一種具有自組裝性能的肝素-紫杉醇前藥系統(tǒng)(Prodrugs)。在核磁共振(NMR)、紅外光譜(FT-IR)及凝膠滲透色譜(GPC)對藥物系統(tǒng)結(jié)構(gòu)表征的基礎(chǔ)上,開展了藥物輸送系統(tǒng)的水解動(dòng)力學(xué)、藥物體系的抗凝

4、活性研究,考察了藥物系統(tǒng)對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的體外抗癌抑制活性,通過應(yīng)用細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞儀分析藥物系統(tǒng)的抗腫瘤作用機(jī)理,以及進(jìn)行了體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.抗癌藥物模型輸送系統(tǒng)
　　 在抗癌藥物模型藥物系統(tǒng)中分別應(yīng)用乙?；?芐氧基化和正丁胺化對肝素進(jìn)行修飾,形成了一元化,二元化和三元化肝素模型藥物系統(tǒng)。利用O-乙酰化反應(yīng)對肝素進(jìn)行化學(xué)修飾,得到重要活性中間體混酐,藥物分子模型芐醇與肝素通過相對較

5、易水解的酯鍵進(jìn)行連接,靶因子模型正丁胺與肝素之間以酰胺鍵進(jìn)行連接,形成“藥物分子模型芐醇-乙酰化肝素-靶因子模型正丁胺”的三元化模型藥物輸送系統(tǒng)。
　　 研究表明活性中間體混酐對二元化肝素衍生物有較大的影響,且乙?；〈?重量百分?jǐn)?shù))為8.5％,芐氧基為3.21％,正丁胺為1.3％,是一種理想的模型體系。引入基團(tuán)重量呈下降趨勢,符合實(shí)際藥物體系中,要求藥物分子含量大于靶因子的含量特點(diǎn)。
　　 抗凝活性表明模型抗癌藥物系

6、統(tǒng)的抗凝血活性有不同程度地降低,說明該系統(tǒng)能夠成為一種安全,有效的藥物系統(tǒng),避免臨床使用中的出血現(xiàn)象,該模型體系具有應(yīng)用前景,為接下來的工作奠定了研究基礎(chǔ)。
　　 2.直接化學(xué)鍵連接的肝素一紫杉醇藥物輸送系統(tǒng)(HD1)和以氨基酸連接臂連接的肝素-紫杉醇藥物輸送系統(tǒng)(HD2)
　　 應(yīng)用模型反應(yīng)過程,制備了兩種藥物輸送系統(tǒng):以直接化學(xué)鍵酯鍵連接的肝素-紫杉醇藥物輸送系統(tǒng)(HD1),和以纈氨酸、亮氨酸和苯丙基酸為連接臂連接的

7、肝素-紫杉醇藥物輸送系統(tǒng)(HD2a,HD2b,HD2c)。
　　 通過測定直接化學(xué)鍵相連的藥物體系(HD1)中,載藥量為25.4％,用氨基酸為連接臂的藥物系統(tǒng)(HD2a,HD2b,HD2c)中,載藥量分別為16.3％,18.4％,16.1％。
　　 討論了兩種體系的體外藥物釋放作用,表明沒有連接臂連接的肝素-紫杉醇藥物輸送系統(tǒng)(HD1)在中性和酸性磷酸鹽緩沖液以及酶催化條件下,具有很高的穩(wěn)定性很難釋放出活性藥物,說明該肝

8、素-紫杉醇藥物輸送系統(tǒng)(HD1)并不適合于進(jìn)一步的研究。
　　 而帶有氨基酸連接臂的肝素-紫杉醇藥物輸送系統(tǒng)(HD2)具有一定的水解釋放速度,隨著磷酸鹽緩沖液pH值下降,三種藥物系統(tǒng)水解速度均變緩慢;而在類似體內(nèi)條件酶催化下,三種體系水解速度大大增加,以纈氨酸和亮氨酸為連接臂的藥物體系HD2a和HD2b能夠釋放出較多的活性藥物,且后者快于前者;總體來說,帶有氨基酸連接臂的藥物系統(tǒng)具有較好的應(yīng)用前景。
　　 抗凝活性表明兩

9、種藥物體系的抗凝活性較肝素均有較大的下降,說明制備的抗癌藥物系統(tǒng)具有較好的安全性,具有進(jìn)一步應(yīng)用研究的可能性。
　　 通過MTT法考察藥物系統(tǒng)對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的體外抗癌抑制活性,檢測表明,HD1的半數(shù)抑制濃度IC50為3.09μg/mL,高于原藥紫杉醇,而以氨基酸為連接臂的肝素-紫杉醇藥物輸送系統(tǒng)的半數(shù)抑制濃度IC50分別為0.97μg/mL,0.48μg/mL,0.43μg/mL,相比較原藥紫杉醇IC50低2～3倍,說

10、明該體系能夠釋放出活性藥物,具有良好的抑制腫瘤細(xì)胞活性。綜合以上理化性質(zhì),以纈氨酸和亮氨酸為連接臂的藥物體系HD2a和HD2b,具有較好的應(yīng)用前景。3.自組裝肝素-紫杉醇前藥系統(tǒng)(Prodrugs)
　　 鑒于納米尺寸的藥物系統(tǒng)具有一定的“被動(dòng)靶向性”作用,本章在前面工作基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)制備具有納米尺寸的肝素-紫杉醇前藥系統(tǒng)。應(yīng)用丁二酸酐對肝素進(jìn)行化學(xué)修飾,引入更多的羧酸根,將藥物分子與載體通過三種氨基酸纈氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸為連

11、接臂進(jìn)行化學(xué)鍵合,形成前藥體系(Prodrug1,Prodrug2,Prodrug3)。
　　 定量分析表明,前藥體系中引入丁二?；闹亓堪俜?jǐn)?shù)為8.5％,連接紫杉醇重量百分?jǐn)?shù)分別為35.4％,37.8％,39.1％。該結(jié)果表明由于更多羧酸根的引入增加了連接紫杉醇的含量,較前一章的藥物體系有很大的提高。
　　 經(jīng)動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和掃描電鏡(SEM)檢測,這種前藥體系能夠在水溶性條件下,自組裝形成載體在外而藥物分子在內(nèi)

12、的穩(wěn)定的不規(guī)則球形納米顆粒,平均粒徑140～180 nm之間,經(jīng)測定電位在-20 mV左右。
　　 水解動(dòng)力學(xué)表明前藥系統(tǒng)在中性和酸性磷酸鹽緩沖液以及血漿中均能釋放出活性藥物分子,并隨著pH值的降低,體系釋放活性藥物的能力下降;而整個(gè)前藥系統(tǒng)在血漿中具有較快的釋放速度,且大鼠血漿中的穩(wěn)定性低于在人血漿中的穩(wěn)定性,Prodrug2對酶催化條件更為敏感,總體上來說,在兩種水解條件下,Prodrug2是值得期待藥物輸送系統(tǒng)。
　

13、　 抗凝活性表明兩種藥物體系的抗凝活性較載體肝素均有較大的下降,說明一定的化學(xué)修飾能夠降低肝素的抗凝活性,避免用藥過程中出現(xiàn)的出血現(xiàn)象,該抗癌藥物系統(tǒng)具有較好的安全性,具有進(jìn)一步應(yīng)用研究的可能性。
　　 通過MTT法考察藥物系統(tǒng)對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的體外抗癌抑制活性,檢測表明,自組裝功能的肝素-紫杉醇前藥系統(tǒng)的半數(shù)抑制濃度IC5分別為0.10μg/mL,0.058μg/mL,0.06μg/mL,相比較原藥紫杉醇IC50更低

14、,制備的前藥系統(tǒng)的抑癌活性均表現(xiàn)出高于紫杉醇的抑癌活性。建立人卵巢癌SKOV3裸鼠模型體內(nèi)試驗(yàn)表明紫杉醇和Prodrugs單獨(dú)治療組均能抑制腫瘤生長,實(shí)驗(yàn)組與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與紫杉醇組相比,模型組與Prodrugs組裸鼠體重變化較大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而模型組與Prodrugs組裸鼠體重變化不大,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明相比較紫杉醇組,Prodrugs組的對裸鼠毒性不大,是一種