BMSCs在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中的作用.pdf

1、皮膚是人體面積最大的器官,也是機(jī)體自我更新速度最快的組織之一,它是機(jī)體免于脫水、損傷、感染的第一道防線,是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和阻止微生物、化學(xué)物質(zhì)等侵入的屏障。盡早覆蓋創(chuàng)面,恢復(fù)皮膚的屏障功能,十分重要。常規(guī)的治療方法采用自體皮膚或同種異體、異種皮膚的移植和人工替代物覆蓋等,由于存在著供皮來(lái)源有限,同種異體、異種皮肽移植有免疫排斥反應(yīng)或傳染疾病的危險(xiǎn),人工皮膚費(fèi)用昂貴等問(wèn)題,常規(guī)方法難以滿足臨床應(yīng)用的需要。因此,促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷修復(fù)已成為組織修

2、復(fù)領(lǐng)域亟待解決的難題之一,研究皮膚創(chuàng)傷愈合修復(fù)具有重要的理論和實(shí)際意義。
　　 成體干細(xì)胞(adult stem cells,ASCs)是一類具有多向分化潛能的細(xì)胞群體,因其存在于各種組織及器官中,來(lái)源廣泛,不涉及倫理問(wèn)題,在臨床救治中具有廣泛的應(yīng)用前景,已成為近年醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)之一。目前,ASCs已經(jīng)從大多數(shù)組織中被分離和鑒定,并且能夠誘導(dǎo)分化為同一胚層或者不同胚層的細(xì)胞類型,顯示了其多向分化的潛能。很多研究表明,將AS

3、Cs特別是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derivedmesenchymal stem cells,BMSCs)應(yīng)用于組織損傷修復(fù),取得很好的效果。
　　 創(chuàng)傷形成的創(chuàng)面從根本上說(shuō)是組織缺損,而干細(xì)胞獨(dú)特的多向分化潛能、自我更新能力和增殖分化能力強(qiáng)的重要特性,正好滿足皮膚修復(fù)的需要。大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),BMSCs在體內(nèi)、體外可以分化為表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞,這都為干細(xì)胞治療皮膚創(chuàng)傷后缺損提供了理論支持。<

4、br>　　 因此,針對(duì)皮膚創(chuàng)傷修復(fù),本研究將BMSCs引入皮膚創(chuàng)傷后的創(chuàng)面治療,圍繞干細(xì)胞在創(chuàng)傷部位募集這一主題,明確BMSCs可以通過(guò)動(dòng)員、募集作用參與創(chuàng)傷后組織修復(fù),進(jìn)一步作深入細(xì)致的研究,并初步探討干細(xì)胞在創(chuàng)傷部位募集的機(jī)制,為臨床治療各種皮膚缺損提供了新的治療思路。
　　 本研究首先對(duì)小鼠的BMSCs進(jìn)行分離、培養(yǎng),并對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)分化、鑒定,在此基礎(chǔ)上觀察了移植的BMSCs在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中募集現(xiàn)象,重點(diǎn)明確移植的B

5、MSCs可以向創(chuàng)面募集,促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷的修復(fù);同時(shí),我們進(jìn)一步探討了其可能的機(jī)制,根據(jù)已知的趨化原理,采用基因轉(zhuǎn)染的方法修飾BMSCs,促進(jìn)BMSCs向創(chuàng)面的遷移,增加BMSCs向創(chuàng)面募集的數(shù)量,進(jìn)一步提高BMSCs修復(fù)皮膚創(chuàng)傷的效果。
　　 主要結(jié)果和結(jié)論:
　　 1.本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁法分離純化BALB/C雄性小鼠的BMSCs,體外培養(yǎng)可大量擴(kuò)增和傳代,獲得了體外培養(yǎng)擴(kuò)增BMSCs的簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、高效的方法;通過(guò)實(shí)驗(yàn)鑒

6、定及觀察,BMSCs體外具有成骨、成脂肪誘導(dǎo)分化的潛能,已經(jīng)符合種子細(xì)胞的基本條件,無(wú)論其“質(zhì)和量”均能夠滿足進(jìn)一步研究和應(yīng)用的需要。
　　 2.本實(shí)驗(yàn)中采用Co60全身照射(照射劑量3.5Gy),使骨髓產(chǎn)生放射性損傷以造成受體骨髓滅活,為移植的BMSCs留出空間,減少了動(dòng)物自體骨髓干細(xì)胞的影響,移植培養(yǎng)的BMSCs后,成功建立骨髓移植嵌合體模型,以模擬自體BMSCs的作用,滿足實(shí)驗(yàn)需求。本實(shí)驗(yàn)骨髓移植嵌合體皮膚創(chuàng)傷動(dòng)物模型的成

7、功建立,為各種免疫功能不同小鼠放創(chuàng)復(fù)合傷模型建立提供了參考。
　　 3.本實(shí)驗(yàn)中,利用了三種不同細(xì)胞標(biāo)記方式:CFDA-SE熒光標(biāo)記、Y染色體標(biāo)記、攜帶GFP基因的病毒載體轉(zhuǎn)染標(biāo)記BMSCs,通過(guò)給受體雌性BALB/C小鼠尾靜脈注射來(lái)源于供體雄性BALB/C小鼠的標(biāo)記BMSCs,分別利用組織切片后普通熒光顯微鏡觀察,定量Real-timePCR檢測(cè)創(chuàng)面組織中Y染色體的表達(dá),以及冰凍切片后DAPI復(fù)染激光共聚焦顯微鏡觀察,結(jié)果顯示

8、,無(wú)論從直觀的現(xiàn)象觀察,還是從創(chuàng)面組織Y染色體檢測(cè),都清楚地證實(shí)了BMSCs可以募集到創(chuàng)面,并參與了皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)。
　　 4.創(chuàng)傷后免疫功能正常的BALB/C鼠創(chuàng)面的愈合時(shí)間為14.00±1.41d,而免疫功能缺陷的裸鼠、SCID鼠創(chuàng)面的愈合時(shí)間分別為17.16±1.17d和19.83±0.76d,與BALB/C鼠比較存在顯著差異(P＜0.01)。
　　 5.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR檢測(cè)創(chuàng)面組織中SDF-1的基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)

9、,創(chuàng)面愈合過(guò)程中BALB/C鼠SDF-1基因表達(dá)于傷后1d即有增高,5d達(dá)峰值(P＜0.01),然后逐漸下降,但仍明顯高于對(duì)照組,14d創(chuàng)面基本愈合時(shí)接近對(duì)照組。而裸鼠、SCID鼠創(chuàng)面中SDF-1基因表達(dá)于傷后逐漸增高,所測(cè)時(shí)相點(diǎn)中傷后7d達(dá)峰值(P＜0.01),與BALB/C鼠相比,SDF-1基因表達(dá)峰值延后,然后逐漸下降,14d創(chuàng)面未愈合時(shí),SDF-1基因表達(dá)仍高于對(duì)照組。本研究結(jié)果表明,SDF-1既是調(diào)節(jié)局部炎癥的重要趨化因子,也

10、是調(diào)節(jié)組織器官損傷修復(fù)的關(guān)鍵細(xì)胞因子。正常皮膚基礎(chǔ)性表達(dá)SDF-1;創(chuàng)傷后,創(chuàng)面SDF-1表達(dá)增加,BMSCs募集到達(dá)創(chuàng)面,參與修復(fù)。另外機(jī)體的免疫功能也將影響B(tài)MSCs募集,從而影響創(chuàng)面愈合。這為臨床上治療各種創(chuàng)面,加速創(chuàng)面的盡早愈合提供了新的研究思路和方法。
　　 6.本實(shí)驗(yàn)成功地構(gòu)建了CXCR4的腺病毒表達(dá)載體Adv-CXCR4,并轉(zhuǎn)染BMSCs,尾靜脈回輸BMSCs檢測(cè)創(chuàng)面組織中Y染色體的表達(dá),結(jié)果顯示:無(wú)論未轉(zhuǎn)染Adv

11、-CXCR4的BMSCs還是Adv-CXCR4轉(zhuǎn)染的BMSCs移植,傷后1d,創(chuàng)面即檢測(cè)到Y(jié)染色體,最高峰出現(xiàn)在傷后5d,持續(xù)明顯表達(dá)14d以上;與未轉(zhuǎn)染Adv-CXCR4的BMSCs相比,Adv-CXCR4轉(zhuǎn)染的BMSCs移植后能更多地分布于BALB/C鼠的創(chuàng)面,二者相差顯著(P＜0.01)。同時(shí),將Adv-CXCR4轉(zhuǎn)染的BMSCs移植到BALB/C鼠的體內(nèi)后,其創(chuàng)面平均愈合時(shí)間為12.46±1.17d,較移植未轉(zhuǎn)染Adv-CXCR