辣椒疫霉菌4個果膠甲基酯酶基因的克隆和pcpme6的真核表達研究.pdf

1、辣椒疫病在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生的土傳病害,嚴重影響世界各國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn),造成巨大的經(jīng)濟損失,病原是辣椒疫霉菌(Phtophthoracapsici)。辣椒疫霉菌是一種土傳卵菌,以卵孢子或厚垣孢子在土壤病殘體中越冬,可以存活數(shù)月甚至更長時間,在適宜條件下引起青椒莖腐、根腐和枯萎；寄主范圍廣,除侵染辣椒外,還可以侵染西葫蘆、黃瓜、番茄等20多種作物。 目前,對于辣椒疫病的防治主要采用化學(xué)防治,而培育抗病品種效果不穩(wěn)定,原因之一是辣椒疫霉

2、具有較強的變異能力。因此,探索辣椒疫霉菌重要的致病因子,研究抗病性生理生化機制,結(jié)合抗病性遺傳,抗病基因的QTL定位(quantitative trait loci)與基因工程,進行抗病性鑒定和抗病育種方面研究成為病害防治的前景。其中細胞壁降解酶在病害致病關(guān)鍵因子之一,包括角質(zhì)酶(cutinase),果膠酶(pectinase),纖維素酶(cellulase),半纖維素酶(hemicellulase),蛋白酶(protease)等。而果

3、膠酶又包括多聚半乳糖醛酸酶(PG),果膠甲基酯酶(PME),果膠裂解酶(PL)。果膠甲基酯酶(PME)是許多植物病原菌分泌的一種果膠酶,能降解植物細胞壁,許多病原真菌,卵菌,細菌在侵染過程都能分泌果膠甲基酯酶。本文以辣椒疫霉菌為研究對象,克隆辣椒疫霉果膠甲基酯酶基因及表達研究。 以辣椒疫霉強致病和果膠甲基酯酶活性高的菌株為實驗材料構(gòu)建的DNA文庫,借助Pool-PCR技術(shù)分離了4個果膠甲基酯酶基因。對基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)4個pme基

4、因具有很高的同源性,并具有不同數(shù)目的糖基化位點。所編碼的蛋白具果膠甲基酯酶的保守序列和蛋白活性位點。本研究發(fā)現(xiàn),辣椒疫霉pme基因與卵菌pme基因具高度保守序列,也證明了卵菌在自然界中的分類地位。并且對其中一個基因構(gòu)建質(zhì)粒進行體外誘導(dǎo)表達,制備了多克隆抗體,借助蛋白印記雜交驗證了重組蛋白的免疫活性,其具體研究結(jié)果如下： 1、Pool-PCR法篩選基因文庫,分離了4個果膠甲基酯酶基因 從GenBank中下載若干pme基因,

5、同源比對設(shè)計多對引物(P230+AP650,P230+P920,P230+P795,P445+P920,P445+AP650,P620+P920,P650+P920,P445+P795),然后進行反復(fù)篩選,分離了3個全長和1個非全長基因。利用引物P230+AP650篩選出pcpme6,P650+P920篩選出pcpme7和pcpme8,其中P445+P920和P445+P795均能擴增出pcpme9。將所克隆的4個基因經(jīng)過blast,顯

6、示全部為果膠甲基酯酶基因。經(jīng)過DNAman軟件處理分析了這4個基因的基本結(jié)構(gòu),最大開放閱讀框長度差別不大,均在1100bp左右,編碼345-348個氨基酸,預(yù)測氨基酸分子量為37-38kDa。利用http://www.expasy.org和http://www.cbs.dfu.dk/service/signalP對這四個基因的信號肽和N糖基化位點進行預(yù)測,信號肽長度16-20個氨基酸不等,N-端糖基化位點4-7個不等,4個基因的理論PI

7、值為5-9。 2、RACE技術(shù)擴增pcpme9的3'端 將辣椒疫霉菌置于三角瓶進行振蕩培養(yǎng)7天后,收集菌絲。然后液氮研磨,利用Trizol法提取總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶作用,合成cDNA,作為模板,以通用引物(USP)和基因特異引物(GSP)進行第一輪PCR;以第一輪產(chǎn)物做模板,用巢式特異引物(NGSP)和巢式通用引物(NUSP)進行第二輪PCR,目的片段回收,連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α后,送樣測序。將測序片段拼接后,對其

8、進行了初步分析,果膠甲基酯酶基因pcpme9序列全長為1041 bp,最大開放閱讀框ORF為1038bp(1-1038),ORF編碼一個346個氨基酸的蛋白質(zhì),預(yù)測編碼產(chǎn)物大小約為38kDa,并有7個N糖基化位點,信號肽含16個氨基酸。 3、pcpme6真核表達和Western blot 根據(jù)已經(jīng)克隆的pcpme6基因序列,設(shè)計特異性引物,PCR擴增其成熟肽片斷。重組至酵母分泌型表達載體pPIC9K,構(gòu)建重組表達載體pP

9、IC9K/pcpme6,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中,篩選得到陽性克隆。重組質(zhì)粒經(jīng)stu I線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞,經(jīng)G418篩選和PCR擴增轉(zhuǎn)化子基因組篩選,得到數(shù)株基因工程酵母菌。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn),重組蛋白進行了特異表達,分子量大小為50KDa左右。通過將酵母分泌的PME蛋白免疫家兔,制備特異性抗體。Western blot分析結(jié)果進一步表明,轉(zhuǎn)基因酵母成功表達,重組抗原有良好的免疫活性,多克隆抗體具有較高特