人組織激肽釋放酶cDNA的克隆、表達(dá)及其基因治療高血壓的初步研究.pdf

1、人組織激肽釋放酶(human tissue kallikrein,KLKI)是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的核心成員,能裂解激肽原的特異肽鍵而釋放激肽,并通過該系統(tǒng)發(fā)揮一系列的生物學(xué)功能.該研究的目的是開發(fā)人組織激肽釋放酶基因工程產(chǎn)品,制備鑒定KLKI的試劑,并探討用KLKI基因治療高血壓的可行性.根據(jù)國(guó)際上發(fā)表的KLKI cDNA序列,以人胰腺cDNA第一鏈為模板,擴(kuò)增KLKI cDNA,所得的KLKI cDNA與已經(jīng)發(fā)表的KLKI cDNA

2、序列完全相同或有幾個(gè)核苷酸差異.將KLKI cDNA的信號(hào)肽切除,按正確的閱讀框架克隆入pGEX-4T-3載體中谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因的下游,用IPTG誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌中的表達(dá).Western-blotting結(jié)果顯示,表達(dá)的約48kDa的融合蛋白能夠被GST單抗特異性識(shí)別.以原核表達(dá)產(chǎn)物為抗原,分別制備了針對(duì)KLKI的多抗血清和單克隆抗體.以KLKI的重組載體注射小鼠也獲得了較高效價(jià)的特異抗體.把KLKI cDNA克隆

3、入真核表達(dá)載體pcDNA3中,通過多聚乙酸亞胺介導(dǎo)將真核表達(dá)重組載體轉(zhuǎn)染入COS-1細(xì)胞,用所制備的抗體做間接免疫熒光反應(yīng),結(jié)果說明KLKI在真核細(xì)胞中獲得了表達(dá).通過注射此重組真核表達(dá)載體基因治療自發(fā)性高血壓大鼠(SHR),降壓幅度達(dá)30mmHg,維持2周左右.將KLKI cDNA克隆入該室構(gòu)建的乳腺特異性表達(dá)載體p205C3中,用獲得的重組載體注射哺乳期小鼠中,乳汁中的KLKI活性高達(dá)292U/ml.這些結(jié)果表明,該試驗(yàn)克隆的KLK