硫化氫通過PI3K-AKT-NF-κB通路調(diào)控急性壞死性胰腺炎.pdf

1、研究背景和目的：急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)是臨床常見的危重急腹癥之一，發(fā)病兇險，可導(dǎo)致全身多器官功能衰竭(multi-organ failure，MOF)，死亡率高達(dá)20%-60%。自1988年Rindernecht提出ANP的“白細(xì)胞過度激活學(xué)說”以來，細(xì)胞因子成為ANP的研究熱點。通過多年研究，現(xiàn)認(rèn)為ANP時各種促炎細(xì)胞因子是導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic in

2、flammation response syndrome，SIRS)發(fā)生的關(guān)鍵因素，而SIRS是造成全身多器官功能障礙綜合癥(multi-organ dysfunction syndrome，MODS)的重要原因。如何才能有效調(diào)控細(xì)胞因子的產(chǎn)生和相互作用，阻斷SIRS和MODS的發(fā)生，對于防治ANP具有重要的意義。近年來，隨著對多種炎癥模型的研究日益加深，發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)的激活是由細(xì)胞內(nèi)外多條信號傳導(dǎo)通路實現(xiàn)的，并發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇-3-激酶/

3、絲氨酸/蘇氨酸激酶(phosphatidylinositol-3-kinase/serine/threonine kinase，PI3K/AKT)通路參與大多數(shù)炎癥過程；當(dāng)PI3K/AKT磷酸化后，進(jìn)一步激活核轉(zhuǎn)錄因子(nuclearfactor-κB，NF-κB)，并啟動和調(diào)控細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。鑒于此，我們認(rèn)為該信號通路可能是炎癥反應(yīng)過程中的關(guān)鍵信號通路之一，如果能對其進(jìn)行有效的調(diào)節(jié)和阻斷，則能遏制細(xì)胞

4、因子的產(chǎn)生和相互作用，從而阻斷SIRS和MODS的發(fā)生或減輕其嚴(yán)重程度，提高ANP的治療效果。
　　 硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是一種小分子質(zhì)量脂溶性氣體分子，可以自由滲透入細(xì)胞膜發(fā)揮生物效應(yīng)，因此，它被認(rèn)為是繼CO、NO后的第三種新型氣體分子。在哺乳動物體內(nèi)，H2S主要以L-半胱氨酸為底物通過激活5’-磷酸吡哆醛依賴性酶：胱硫醚-γ裂解酶(cystathionineγ-lyase，CSE，EC4.4.1

5、.1)和胱硫醚-β合成酶(cystathionineβ-synthase，CBS，EC4.2.1.22)生成；同時，還可以以α酮戊二酸為底物通過3-巰基丙酮酸鹽硫轉(zhuǎn)移酶(3-Mercaptopyruvate sulfurtransferase，3MTS)而產(chǎn)生。已有大量證據(jù)顯示H2S在調(diào)節(jié)血管、胃腸道、心肌收縮，神經(jīng)傳遞和胰島素分泌等方面起著重要的作用，但其在炎癥過程中的作用尚存爭議。
　　 基于此，本實驗通過腹腔注射左旋精氨酸

6、制作SD大鼠ANP模型，給予CSE抑制劑炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine，PAG)和不同劑量的外源性H2S載體(NaHS)，檢測各組大鼠血淀粉酶及血漿H2S含量，Real-time PCR法檢測胰腺組織中CSEmRNA的表達(dá)水平，并使用PI3K抑制劑wortmannin預(yù)處理各組ANP大鼠，Western blotting法檢測各組大鼠胰腺組織磷酸化AKT(p-AKT)及IκBα水平，EMSA法檢測NF-κB活性，E

7、lisa法檢測血漿IL-6含量、胰腺組織中髓過氧化物酶(Myeloperoxidas，MPO)活性。探討H2S通過PI3K-AKT通路調(diào)節(jié)ANP炎癥反應(yīng)，以期能為早期干預(yù)ANP提供新的靶點。
　　 研究方法：
　　 1.用腹腔內(nèi)注射6%左旋精氨酸制作SD大鼠ANP模型。
　　 2.實驗分組：
　　 1)對照組(n=6)：SD大鼠腹腔內(nèi)注射等量生理鹽水。
　　 2)ANP組(n=10)：SD大鼠腹腔

8、內(nèi)注射6%左旋精氨酸3g/kg，分三次注射，每次間隔1小時。
　　 3)PAG+ANP組(n=10)：注射精氨酸前1h，大鼠腹腔內(nèi)注射PAG50mg/kg。
　　 4)5mg/kgNaHS+ANP組(n=10)：注射精氨酸前1h，大鼠腹腔內(nèi)注射NaHS5mg/kg。
　　 5)10mg/kgNaHS+ANP組(n=10)：注射精氨酸前1h，大鼠腹腔內(nèi)注射NaHS10mg/kg。
　　 6)20mg/kgN

9、aHS+ANP組(n=10)：注射精氨酸前1h，大鼠腹腔內(nèi)注射NaHS20mg/kg。
　　 7)100mg/kgNaHS+ANP組(n=10)：注射精氨酸前1h，大鼠腹腔內(nèi)注射NaHS100mg/kg。
　　 8)wortmannin(W)+ANP組(n=10)：注射精氨酸前0.5h，大鼠腹腔內(nèi)注射wortmannin1.4mg/kg。
　　 9)5mg/kgNaHS+wortmannin(W)+ANP組(n=

10、10)：注射精氨酸前1h，大鼠腹腔內(nèi)注射NaHS5mg/kg，前0.5h腹腔注射wortmannin1.4mg/kg。
　　 10)100mg/kgNaHS+wortmannin(W)+ANP組(n=10)：注射精氨酸前1h，大鼠腹腔內(nèi)注射NaHS100mg/kg，前0.51h腹腔注射wortmannin1.4mg/kg。
　　 3.采用化學(xué)法檢測對照組、ANP組、PAG+ANP組、5mg/kg NaHS+ANP組、10

11、mg/kgNaHS+ANP組、20mg/kg NaHS+ANP組及100mg/kg NaHS+ANP組大鼠血淀粉酶及血漿H2S含量；Real-time PCR法檢測大鼠胰腺CSEmRNA水平。
　　 4.采用Western blotting法檢測各組大鼠胰腺組織p-AKT及IκBα水平，EMSA法檢測NF-κB活性，Elisa法檢測血漿IL-6含量、胰腺組織MPO活性。
　　 結(jié)果：
　　 1.ANP組和PAG+

12、ANP組血漿H2S和胰腺組織CSE mRNA水平較對照組顯著降低(P<0.01)，且PAG+ANP組低于ANP組(P<0.01)，不同劑量NaHS組血漿H2S和胰腺組織CSEmRNA水平隨著NaHS濃度升高而逐漸升高。
　　 2.ANP組和PAG+ANP組血淀粉酶及血漿IL-6、胰腺組織MPO活性水平較對照組顯著升高(P<0.01)，且PAG+ANP組高于ANP組(P<0.01)，不同劑量NaHS組血淀粉酶及血漿IL-6、胰腺組

13、織MPO活性水平隨著NaHS濃度升高逐漸降低。給予wortmannin后，血漿IL-6及MPO活性進(jìn)一步降低。
　　 3.ANP組和PAG+ANP組胰腺組織p-AKT水平較對照組明顯升高(P<0.01)，且PAG+ANP組高于ANP組(P<0.01)，不同劑量NaHS組胰腺組織p-AKT水平隨著NaHS濃度升高而逐漸降低；wortmannin+ANP組較ANP組p-AKT水平降低(P<0.01)，5mg/kgNaHS+wortm

14、annin+ANP組較5mg/kg NaHS+ANP組p-AKT水平降低(P<0.01)，100mg/kg NaHS+wortmannin+ANP組較100mg/kg NaHS+ANP組p-AKT水平降低(P<0.01)。
　　 4.ANP組和PAG+ANP組胰腺組織IκBα水平較對照組明顯降低(P<0.01)，且PAG+ANP組低于ANP組(P<0.01)，不同劑量NaHS組胰腺組織IκBα水平隨著NaHS濃度升高而逐漸升高；

15、wortmannin+ANP組較ANP組IκBα水平升高(P<0.01)，5mg/kgNaHS+wortmannin+ANP組較5mg/kg NaHS+ANP組IκBα水平升高(P<0.01)，100mg/kgNaHS+wortmannin+ANP組較100mg/kg NaHS+ANP組IκBα水平升高(P<0.01)。
　　 5.ANP組和PAG+ANP組胰腺組織NF-κB活性較對照組明顯增強，且PAG+ANP組較ANP組增強

16、，不同劑量NaHS組胰腺組織NF-κB活性隨著NaHS濃度升高而逐漸減弱；wortmannin+ANP組較ANP組NF-κB活性減弱，5mg/kg NaHS+wortmannin+ANP組較5mg/kg NaHS+ANP組NF-κB活性減弱，100mg/kg NaHS+wortmannin+ANP組較100mg/kg NaHS+ANP組NF-κB活性減弱。
　　 結(jié)論：
　　 1.內(nèi)源性H2S的減少參與了ANP發(fā)病的病理