腸源性內(nèi)毒素血癥在阿爾茨海默病發(fā)病中作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、老年性癡呆是一種慢性進(jìn)行性精神衰退性疾病，臨床表現(xiàn)以癡呆癥狀最為突出，病理改變以大腦的萎縮和變性為主。多年來(lái)對(duì)AD的病因做了大量的研究，但迄今為止，病因仍不明，確切的致病因素并未找到。因?yàn)椴∫驑O其復(fù)雜，有患者自身的生物學(xué)因素，也有多種環(huán)境與社會(huì)因素的影響。 在腸源性內(nèi)毒素血癥(Intestinalendotoxemia，IETM)中發(fā)揮核心作用的內(nèi)毒素是革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁外膜表層構(gòu)成成份，是脂多糖(LPS)與蛋白的復(fù)合體，是體

2、內(nèi)巨噬細(xì)胞最敏感的激活劑。正常腸道中含有大量的細(xì)菌和內(nèi)毒素，生理狀態(tài)下由于腸粘膜屏障的保護(hù)作用，腸腔中存在的內(nèi)毒素只有極少量進(jìn)入外周循環(huán)，對(duì)機(jī)體維持一定的免疫力可能有意義；同時(shí)肝臟的枯否細(xì)胞也會(huì)吞噬清除血液中過(guò)多的內(nèi)毒素，防止IETM的發(fā)生。但是，當(dāng)機(jī)體受到嚴(yán)重創(chuàng)傷(包括手術(shù))、燒傷、放化療和長(zhǎng)期傳統(tǒng)的腸外營(yíng)養(yǎng)時(shí)，腸粘膜有可能發(fā)生通透性增高；或枯否細(xì)胞吞噬活性嚴(yán)重下降，對(duì)血漿中內(nèi)毒素清除能力下降時(shí)，就有可能導(dǎo)致細(xì)菌及內(nèi)毒素移位，引起內(nèi)源

3、性感染，甚至多臟器功能衰竭(MOF)。 內(nèi)毒素是到目前為止已知的誘導(dǎo)IL-1、TNF-α等最重要的因子，可以充分激活巨噬細(xì)胞，釋放大量炎癥因子，激活細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)： 1、枯否細(xì)胞活化后可生成和釋放TNF-α、IL-1、IL-6、血小板激活因子(platelet-activatedfactor，PAF)、PGs等細(xì)胞因之的分泌，損傷肝細(xì)胞；枯否細(xì)胞活化后所釋放的白三烯，特別是LT-B4具有強(qiáng)烈的化學(xué)趨化作用，吸引并激活中性

4、粒細(xì)胞，產(chǎn)生并釋放自由基，使細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化而損傷細(xì)胞。 2、枯否細(xì)胞活化后生成和釋放的活性氧中間產(chǎn)物(ROI)可引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，損傷生物膜系統(tǒng)、核酸和蛋白質(zhì)導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡。 3、枯否細(xì)胞與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞是花生四烯酸特別是PGD2、PGE2及血栓素的重要來(lái)源，可經(jīng)對(duì)應(yīng)的受體作用于肝細(xì)胞，引起蛋白磷酸化及膜穩(wěn)定性變化。 通過(guò)以上機(jī)制，IETM會(huì)導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合癥(SIRS)、多器官功能不全(MO

5、D)，甚至多器官功能衰竭(MOF)。 綜上所述，IETM會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重的SIRS，而局部炎癥在AD的病理生理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。那么同樣高發(fā)于老年人的IETM與AD二者之間有何聯(lián)系?IETM會(huì)不會(huì)是AD發(fā)病的一個(gè)危險(xiǎn)因素?IETM在AD發(fā)病過(guò)程中有何作用?目前尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道，為此，設(shè)計(jì)了本次課題研究研究計(jì)劃。 本研究由以下三個(gè)部分組成： 第一部分、D-半乳糖和三氯化鋁建立的AD大鼠模型的研究。 實(shí)

6、驗(yàn)?zāi)康募氨尘埃宏P(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制目前有膽堿能學(xué)說(shuō)、基因突變和多態(tài)性學(xué)說(shuō)、自身免疫學(xué)說(shuō)、能量代謝障礙學(xué)說(shuō)等。目前，依據(jù)各種學(xué)說(shuō)已建立了多種AD動(dòng)物模型，但每種模型均有一定的局限性，不能全面模擬AD的病理特征。為了建立一種準(zhǔn)確可靠的AD模型，進(jìn)行了本次實(shí)驗(yàn)，以期為AD研究提供一種新的大鼠模型。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、AD模型制備。 2、Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。 2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)。 2.2 空間探索

7、實(shí)驗(yàn)。 3、大鼠腦組織總蛋白(TP)、組織過(guò)氧化物酶(POD)、總抗氧化能力(T—AOC)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)、膽堿酯酶(ChE)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)測(cè)定。 4、大鼠腦組織Tau蛋白濃度檢測(cè)：雙抗體夾心式酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。 5、大鼠腦組織凋亡測(cè)定：TUNEL法與流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 6、大鼠腦組織電鏡觀察。 7、大鼠腦組織Aβ1-40檢測(cè)：免疫組織化學(xué)法。

8、 8、大鼠腦組織APP、PS1和BACEmRNA檢測(cè)：兩步法半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：腹腔注射D—半乳糖和AlCl3可以成功制備阿爾茨海默病模型，為AD的研究提供了一種新的大鼠模型。 第二部分、IETM在AD模型發(fā)病中相關(guān)機(jī)制研究。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘埃?IETM假說(shuō)是韓德五教授于1995年首次提出的肝功能衰竭發(fā)生的機(jī)制。在IETM中發(fā)揮核心作用的內(nèi)毒素可以激活枯否細(xì)胞

9、分泌多種活性物質(zhì)(如細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)、自由基等)，可引起“繼發(fā)性肝損傷”，甚至?xí)?dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合癥(SIRS)、多器官功能不全(MOD)，甚至多器官功能衰竭(MOF)的發(fā)生。 炎癥機(jī)制假說(shuō)在AD發(fā)病機(jī)制的眾多假說(shuō)中占有重要的地位，大量的研究證明在AD發(fā)生過(guò)程中腦內(nèi)有大量的炎性因子，如TNF—α、IL-1、IL-6、TGF—β、COX-2、補(bǔ)體及急性期反應(yīng)蛋白的分泌。這些炎性因子通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)道途徑，如NF—KB、MAP

10、K途徑激活神經(jīng)MG和AC，使之釋放更多的炎性因子，同時(shí)它們又共同參與了腦局部炎癥過(guò)程，與Aβ和Tau蛋白的沉積緊密相關(guān)，這些研究確定了局部炎癥在AD的病理生理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。 在本研究所制備的AD模型體內(nèi)是否也出現(xiàn)了IETM?如果是，IETM與AD二者之間有無(wú)內(nèi)在的聯(lián)系?IETM是否參與了AD的發(fā)病過(guò)程?IETM會(huì)不會(huì)是AD發(fā)病的一個(gè)危險(xiǎn)因素?目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，為此進(jìn)行了第二部分實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、血

11、漿LPS、TNF—α、IL-1β及IL-10測(cè)定：采用改良過(guò)氯酸法檢測(cè)血漿LPS含量；放射免疫分析法測(cè)定血漿中TNF—α、IL-1β及IL-10含量。 2、大鼠肝臟枯否細(xì)胞功能狀態(tài)檢測(cè)：免疫組織化學(xué)SABC染色法檢測(cè)肝組織溶菌酶LYZ陽(yáng)性細(xì)胞—KC的數(shù)量和形態(tài)。 3、二胺氧化酶(Diamine oxidase，DAO)、谷氨酰胺(Glutamine，Gin)及谷氨酰胺酶(Glutaminase)活性檢測(cè)：DAO采用黎君友

12、等分光光度計(jì)法，谷氨酰胺采用酚一次氯酸法檢測(cè)，谷氨酰胺酶活性采用熒光法測(cè)定。 4、腸粘膜常規(guī)HE染色，光鏡下觀察粘膜結(jié)構(gòu)變化。 5、大鼠血清S-100β測(cè)定：雙抗體夾心式酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。 6、大鼠腦組織ZO-1蛋白檢測(cè)：免疫印跡法。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 腹腔注射D—半乳糖和AlCl3制備的AD模型大鼠KC吞噬功能、腸粘膜屏障及血腦屏障功能均明顯下降，血漿中LPS及TNF—α、IL-1β等炎癥

13、因子含量增高，AD大鼠體內(nèi)出現(xiàn)了IETM。 第三部分、LPS激活BV-2細(xì)胞及其分子機(jī)制的研究。 研究目的及背景：腦內(nèi)炎癥在AD、帕金森病等慢性神經(jīng)變性疾病發(fā)病機(jī)理上發(fā)揮著重要作用。作為腦內(nèi)固有免疫細(xì)胞的MG在AD發(fā)病中的急性與慢性神經(jīng)炎癥過(guò)程中均擔(dān)當(dāng)了重要的角色。 MG被激活后產(chǎn)生釋放大量的前體炎癥因子，可以產(chǎn)生細(xì)胞毒性因子(蛋白水解酶、細(xì)胞因子、興奮性氨基酸、毗啶、2，3—二羧酸、補(bǔ)體蛋白、活性氧媒介物、一氧

14、化氮等)，Seabrook等的實(shí)驗(yàn)證明腦內(nèi)炎癥和MG有著密切關(guān)系，LPS誘導(dǎo)MG激活產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子TNF—α、IL-1、IL-6，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有PTK途徑、磷酸脂酶A2(PLA2)途徑，還與細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子NF—κB、CREB等的活化有關(guān)。 有研究表明，Aβ在AD發(fā)病中的毒性作用機(jī)制可能與其擾亂細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、產(chǎn)生活性氧和自由基、增加興奮性毒性等作用有關(guān)。 本研究通過(guò)體外培養(yǎng)BV-2細(xì)胞來(lái)研究在IETM中發(fā)揮核心致病作

15、用的LPS對(duì)MG的激活作用、MG激活后釋放的炎癥因子在AD發(fā)病中的作用及其具體機(jī)制，從而進(jìn)一步揭示IETM在AD發(fā)病中的作用及其機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、BV-2細(xì)胞培養(yǎng)。 2、BV-2細(xì)胞分組。 3、BV-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。 4、BV-2細(xì)胞吞噬功能定量測(cè)定。 5、BV-2細(xì)胞OX-42檢測(cè)：免疫熒光法。 6、BV-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF—α、IL-1β測(cè)定：雙抗體夾心式酶聯(lián)免疫吸

16、附法(ELISA)。 7、BV-2細(xì)胞凋亡檢測(cè)。 8、BV-2細(xì)胞p38、JNK、NF—κB蛋白表達(dá)水平檢測(cè)：免疫印跡法。 9、BV-2細(xì)胞[Ca2+]i變化檢測(cè)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： LPS可以通過(guò)p38、JNK、NF—κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路迅速激活BV-2細(xì)胞，提高其吞噬能力，促進(jìn)其分泌炎癥因子；而且，LPS對(duì)BV-2細(xì)胞還有促凋亡作用，并可以使BV-2細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡，發(fā)生鈣超載。 LPS對(duì)BV-2

17、的這種激活作用與Aβ1-40相似，可見(jiàn)LPS在AD的發(fā)病中發(fā)揮了與Aβ1-40類似的致病作用。 通過(guò)以上三部分研究，得出以下結(jié)論： 1、腹腔注射D—半乳糖和AlCl3可以成功制備AD大鼠模型。 2、AD模型大鼠血漿中LPS及炎癥因子水平升高，枯否細(xì)胞吞噬能力、腸粘膜屏障功能及血腦屏障功能均明顯下降，體內(nèi)有IETM的發(fā)生。 3、LPS可以通過(guò)p38、JNK、NF—κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活BV-2細(xì)胞，釋放炎癥因