CaMKδⅡ?qū)π姆考〖?xì)胞鈣離子流影響的研究.pdf

1、鈣離子是一種細(xì)胞內(nèi)重要的電荷載流子，同時(shí)作為一種普遍的介質(zhì)參與各種細(xì)胞過(guò)程。在心肌細(xì)胞里，這些過(guò)程包括基因轉(zhuǎn)錄、興奮-收縮耦聯(lián)及凋亡。眾所周知，細(xì)胞內(nèi)鈣離子傳遞電信號(hào)到機(jī)械活動(dòng)，造成單個(gè)心肌細(xì)胞的短縮進(jìn)而整個(gè)心臟的收縮。然而，近期的研究結(jié)果越來(lái)越多的證據(jù)顯示細(xì)胞內(nèi)鈣超載會(huì)導(dǎo)致許多心臟疾病，如心肌病、心功能不全和心律失常。
　　鈣/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶Ⅱ(CaMKII)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以磷酸化細(xì)胞內(nèi)的許多種蛋白，從

2、而使得細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度提高。CaMKII在正常的心肌細(xì)胞以及病理狀態(tài)下的心肌細(xì)胞里的鈣循環(huán)都起著重要的調(diào)控作用。而且，近期證實(shí)，CaMKII有可能成為一個(gè)針對(duì)心臟疾病治療的潛在藥物靶標(biāo)。許多報(bào)道證實(shí)在心肌肥厚、心力衰竭和心律失常的病例中，CaMKII的活性增加、表達(dá)上調(diào)。在心臟疾病中，CaMKII蛋白的含量和活性程度會(huì)隨著離子通道的高表達(dá)而得到激活和提高。CaMKII有四種亞型α、β、γ及δ，其中δ亞型是CaMKII在心臟最主要的表型

3、。
　　心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位有一個(gè)獨(dú)特的以平臺(tái)期為特征的延長(zhǎng)的除極電位，它的形成主要是鈣離子內(nèi)流與鉀離子外流動(dòng)態(tài)平衡的結(jié)果。在很多心臟疾病中心肌細(xì)胞的電活動(dòng)的改變是由于鈣信號(hào)蛋白的重塑和其它離子通道蛋白的改變而發(fā)生的。CaMKII是一種廣為人知的調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣離子遷移的頻率和幅度的蛋白激酶，能被細(xì)胞CaMKII內(nèi)較高濃度的鈣離子激活，比如當(dāng)心率加快時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣增加，激活CaMKII，活化后的CaMKII可以磷酸化許多種絲氨酸/蘇氨酸鈣

4、調(diào)控蛋白，諸如L型鈣離子通道（LTCC）、軟諾丁受體（RyR2）、基質(zhì)網(wǎng)鈣離子受體2a抑制蛋白(PLN)。心肌細(xì)胞內(nèi)CaMKII通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度而改變動(dòng)作電位的時(shí)程，因此，CaMKII被認(rèn)為可能與增加心律失常的發(fā)生機(jī)會(huì)有關(guān)。但其中的機(jī)制還在不斷探求中。
　　心房纖顫（房顫）是一種臨床上最為常見(jiàn)的心律失常，它的發(fā)生伴隨著血栓栓塞事件的增加和住院率的增加等危害，具有較多的致死率和致殘率。心房纖顫發(fā)生的潛在電生理機(jī)制是快速的異位

5、觸發(fā)心律和折返機(jī)制，而究其發(fā)生主要是由于延長(zhǎng)的動(dòng)作電位時(shí)程及決定于心肌細(xì)胞減慢的電傳導(dǎo)和/或縮短的心房肌細(xì)胞不應(yīng)期。臨床上，在心房纖顫的患者的心房肌細(xì)胞里，發(fā)現(xiàn)存在有異常增高的細(xì)胞內(nèi)鈣蓄積，并且研究證實(shí)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，在心律失常的發(fā)生中起著關(guān)鍵的作用。同時(shí)，在房顫患者的心房肌細(xì)胞里也發(fā)現(xiàn)有CaMKII的異常高表達(dá)。最近，更多的研究者在關(guān)注CaMKII與各種心律失常的聯(lián)系機(jī)制，但更多的試驗(yàn)正在涉及到確認(rèn)是否心房纖顫的發(fā)生及維持與CaMK

6、II直接相關(guān)。
　　給予培養(yǎng)的原代心房肌細(xì)胞以快速的電場(chǎng)刺激，被用來(lái)模擬在體外心房纖顫的細(xì)胞微環(huán)境，且電場(chǎng)刺激被證實(shí)通過(guò)縮短動(dòng)作電位時(shí)程致易于發(fā)生房顫使得心房肌發(fā)生電重構(gòu)。但在這一過(guò)程中CaMKII的功能及作用還未被明確。我們?cè)O(shè)想增加心房肌細(xì)胞內(nèi)CaMKIIδ的表達(dá)量會(huì)影響到基質(zhì)網(wǎng)的鈣釋放以及L型鈣通道鈣離子內(nèi)流，而快速的電場(chǎng)刺激模擬增加的心率致細(xì)胞內(nèi)鈣短暫增加而激活CaMKIIδ，從而改變細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)，致房顫的發(fā)生。

7、　　本研究通過(guò)改變CaMKIIδ表達(dá)量來(lái)探索其在電場(chǎng)刺激導(dǎo)致心肌細(xì)胞鈣變化中的作用，可以為房顫的治療提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　病毒載體構(gòu)建和病毒制備：大鼠CaMKIIδ(NM_012519)的cDNA從Open Biosystems購(gòu)買(7939424)。開(kāi)放閱讀框通過(guò)PCR的方法連接到慢病毒載體LV-IRES-RFP中，得到質(zhì)粒LV-CaMKIIδ-IRES-RFP. CaMKIIδ通過(guò)CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)

8、。為了下調(diào)CaMKIIδ表達(dá)，我們?cè)O(shè)計(jì)了三對(duì)siRNA，并且連入慢病毒載體，此載體中siRNA通過(guò)雙向啟動(dòng)子表達(dá)。所有質(zhì)粒都通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證。慢病毒顆粒通過(guò)將包裝質(zhì)粒和病毒載體共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞獲得，粗制的病毒液收集后超速離心可獲得滴度108 TU/ml的病毒液，用于后繼實(shí)驗(yàn)。
　　原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：從新生大鼠（1-2天）上快速分離心臟，再將心室分離并用0.125％胰酶和0.1％膠原酶I消化。收集單細(xì)胞懸液，按0.5～1×10

9、4/cm2的密度接種于6孔板或玻片上.48小時(shí)后，按MOI=10加入慢病毒。培養(yǎng)48小時(shí)后，將培養(yǎng)基換為新鮮DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞待后繼使用。
　　心肌細(xì)胞電場(chǎng)刺激：培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞置于培養(yǎng)箱內(nèi)，加上連續(xù)電場(chǎng)刺激24小時(shí)。電場(chǎng)由計(jì)算機(jī)控制，電波頻率10Hz，電壓1.5 V/cm。
　　細(xì)胞鈣檢測(cè)：咖啡因刺激的鈣流通過(guò)掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。L型鈣離子通道電流通過(guò)膜片鉗檢測(cè)。挑選帶有紅色熒光的心肌細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。為了消除細(xì)胞

10、大小差異的影響，電流強(qiáng)度定義為電流密度除以細(xì)胞電容。
　　結(jié)果:
　　成功構(gòu)建了CaMKIIδ基因的表達(dá)慢病毒載體，通過(guò)轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞制備慢病毒，可以得到高滴度的病毒液，用此病毒轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞，能夠在細(xì)胞內(nèi)獲得較好的基因表達(dá)。另一方面設(shè)計(jì)了三條干擾序列，通過(guò)轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞并用Western blot檢測(cè)篩選出2＃序列具有較好的干擾效率，將此序列構(gòu)建到慢病毒載體中獲得了干擾CaMKIIδ的病毒載體。
　　成功從

11、新生大鼠心臟分離培養(yǎng)出原代心肌細(xì)胞，并通過(guò)免疫組化和免疫熒光鑒定培養(yǎng)的心肌細(xì)胞純度可達(dá)到90％以上。將制備的慢病毒濃縮到108 TU/ml以上，按MOI=10轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染率可以達(dá)到70％。而進(jìn)一步通過(guò)western blot和qPCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)及干擾病毒的效果，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞CaMKIIδ表達(dá)為對(duì)照病毒的兩倍，而干擾病毒轉(zhuǎn)染后，CaMKIIδ表達(dá)約為對(duì)照病毒的50％。從而成功的在原代細(xì)胞

12、中獲得了CaMKIIδ的過(guò)表達(dá)和干擾。
　　對(duì)原代心肌細(xì)胞進(jìn)行電場(chǎng)刺激后檢測(cè)CaMKIIδ變化，發(fā)現(xiàn)CaMKIIδ的活性增加，但是表達(dá)量未發(fā)生變化。進(jìn)一步檢測(cè)過(guò)表達(dá)和干擾CaMKIIδ的細(xì)胞，其表達(dá)量在電場(chǎng)刺激前后均未發(fā)生變化。在未刺激情況下，CaMKIIδ的表達(dá)變化會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放和L型鈣流的變化。高表達(dá)細(xì)胞中，L鈣流增加了約25％；而低表達(dá)細(xì)胞中，其下降了約28％。在電場(chǎng)刺激情況下，CaMKIIδ表達(dá)依然導(dǎo)致了胞內(nèi)鈣的變化。