生長激素對同型半胱氨酸誘導的腎小球硬化的影響和機制研究.pdf

1、研究背景和目的：大量的研究已經(jīng)證實高同型半胱氨酸血癥(hHcys)是導致心血管疾病和動脈粥樣硬化的一個獨立危險因素。而研究小組及其他實驗室近年的工作也證明hHcys同時與腎小球硬化和損傷密切相關。Hcys通過激活NADPH氧化酶生成過量的超氧陰離子，使得細胞中的ROS水平顯著增加，促進腎小球足細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化(EMT)而參與腎小球的硬化和損傷。生長激素(GH)是腺垂體分泌一種促進組織生長和營養(yǎng)代謝的激素，有報道表明在病理情況下GH

2、可增加血管內(nèi)皮細胞抗氧化物質(zhì)如Mn-SOD，Cu，Zn-SOD，GPx-1和 eNOS的表達分泌，降低細胞中ROS的水平，增加細胞的抗氧化應激反應而發(fā)揮有效的保護作用。而GH是否可以改善Hcys誘導的足細胞的超氧自由基損傷，尚未見相關報道。所以，本實驗通過構(gòu)建小鼠足細胞和C57BL/6J野生型小鼠hHcys損傷模型，體外給予小劑量GH治療，觀察其是否對Hcys所導致腎小球足細胞EMT進程和腎功能損傷有保護作用，及其與NADPH引起的氧化

3、應激反應的關系。
　　 方法：（1）觀察GH對腎小球足細胞EMT的影響及其與NADPH氧化酶活化引起的氧化應激反應的關系。實驗分為5組：正常組、GH組、Hcys組、Hcys+GH組和TGF-b組。用Hcy (40 mM)誘導足細胞EMT的同時給予小劑量GH (25ng/ml)共同孵育，Real Time RT-PCR法檢測上皮細胞標志蛋白P-cadherin和 ZO-1以及間充質(zhì)細胞標志蛋白FSP-1和成纖維細胞標志蛋白a-SM

4、A的mRNA表達，細胞免疫熒光染色和Western Blot法檢測P-cadherin、ZO-1、FSP-1和a-SMA蛋白表達及分布，熒光酶聯(lián)法測定NADPH氧化酶的活性，電子自旋共振技術(shù)檢測細胞O2.-產(chǎn)生，酶聯(lián)免疫吸附實驗觀察足細胞培養(yǎng)基中VEGF-A分泌水平的變化，熒光強度變化法觀察各組細胞單層滲透性的改變，免疫熒光共聚焦檢測Podocin與P-cadherin、ZO-1、FSP-1和a-SMA在細胞共定位，免疫熒光共聚焦檢測N

5、ADPH氧化酶亞基gp91phox或生長激素受體(GHR)在足細胞膜筏中的聚集。觀察膜筏抑制劑Filipin、methyl-β-cyclodextrin (MCD)或NADPH氧化酶抑制劑apocynin與GH聯(lián)用對Hcys誘導的足細胞O2.-產(chǎn)生的影響。（2）體內(nèi)觀察外源性GH對hHcys誘導的足細胞EMT和腎小球損傷的作用：單腎切除法并給予去葉酸食物6W誘導C57BL/6J野生型小鼠高同型半胱氨酸血癥，實驗開始即給基因重組小鼠生長激

6、素皮下注射(0.02 mg/kg.d)，檢測小鼠尿中總蛋白和白蛋白含量的變化，高效液相色譜儀檢測血中Hcy濃度，腎臟病理切片PAS染色觀察腎小球損傷水平，電子自旋共振法檢測腎臟皮質(zhì)NADPH氧化酶依賴的O2.-產(chǎn)生，Real Time RT-PCR法檢測podocin、desmin、GHR、P-cadherin、ZO-1、FSP-1和a-SMA mRNA在腎臟的表達，免疫熒光顯微鏡和Western Blot法檢測腎臟podocin、de

7、smin、P-cadherin、ZO-1、FSP-1和a-SMA表達水平及腎小球內(nèi)共定位的變化。
　　 結(jié)果：（1）與正常組相比較，Hcys組足細胞P-cadherin和ZO-1 mRNA和蛋白質(zhì)水平顯著降低，并出現(xiàn)大量FSP-1和a-SMA表達，與陽性對照TGF-b組的表達相似，提示EMT的增強; GH治療明顯抑制了Hcys引起的足細胞EMT，表現(xiàn)為P-cadherin和ZO-1表達恢復，而FSP-1和a-SMA的表達被顯著抑

8、制。但是，GH對未經(jīng)Hcys處理的足細胞P-cadherin、ZO-1、FSP-1和a-SMA表達水平無顯著影響，提示GH能改善由Hcys導致的足細胞的EMT進程。對NADPH氧化酶活性檢測，證實Hcys顯著增加了NADPH氧化酶活化并加速了細胞內(nèi)O2.-的產(chǎn)生，而GH可以顯著抑制Hcys誘導的NADPH氧化酶活化及O2.-產(chǎn)生。細胞功能實驗證實，Hcys使得細胞的滲透性顯著增強，而細胞培養(yǎng)基中VEGF-A的分泌顯著減少，足細胞的標志物

9、podocin表達顯著下降，而GH可以顯著逆轉(zhuǎn)Hcys造成的足細胞功能的損傷。免疫熒光共聚焦結(jié)果顯示Hcys促使NADPH氧化酶亞單位gp91phox和GHR在膜筏中聚集顯著增加，O2.-生成增多，應用GH、MCD、Filipin和apocynin處理細胞后，由Hcys誘導的膜筏和gp91phox及GHR的聚集及O2.-生成得到顯著抑制。GH抑制CTXB和gp91phox及GHR的聚集及O2.-生成的作用并沒有因為使用膜筏抑制劑和NAD

10、PH氧化酶抑制劑而增加，提示GH可能通過GHR抑制膜筏與gp91pho聚集而發(fā)揮其對足細胞Hcys損傷的保護作用。（2）去葉酸飲食誘導小鼠血Hcy水平顯著升高，GH治療對FF組和ND組小鼠血漿Hcy水平均沒有顯著影響，證明動物模型成功而且GH不是通過降低血漿Hcy水平而發(fā)揮對FF組小鼠腎臟損傷的保護作用。FF組小鼠24小時尿中總蛋白和白蛋白顯著增加，PAS染色提示腎小球的損傷指數(shù)顯著升高，GH治療明顯抑制由FF誘導的尿蛋白排泄增加和腎臟

11、病理損傷。與ND組相比，F(xiàn)F組NADPH依賴的O2.-產(chǎn)生顯著增加，而GH治療顯著抑制了由FF所誘導的O2.-產(chǎn)生，與ND組相比無顯著統(tǒng)計學差異。Real time RT-PCR、免疫熒光和Western Blot結(jié)果均顯示FF組小鼠腎皮質(zhì)podocin表達減少，而足細胞損傷指標desmin表達顯著增加，提示hHcys可以導致腎小球足細胞損傷，而GH治療后podocin表達明顯恢復，desmin則被顯著抑制。對EMT標志物的研究證實，h

12、Hcys抑制了上皮細胞標志物P-cadherin和ZO-1在腎小球表達，而間充質(zhì)細胞標志物FSP-1和a-SMA則顯著增加，提示hHcys能夠促進腎小球足細胞EMT，而GH明顯逆轉(zhuǎn)了hHcys導致的小鼠足細胞EMT改變。Real time RT-PCR和免疫熒光結(jié)果表明FF組小鼠腎皮質(zhì)GHR表達明顯升高，而GH治療后GHR表達回到正常水平，提示GHR表達改變參與了GH抑制FF誘導的腎小球NADPH氧化酶活化和的腎小球損傷的作用。