粘著斑激酶活化對早產(chǎn)鼠高氧肺損傷的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究.pdf

1、第一部分大鼠肺發(fā)育過程中FAK表達變化 [目的]研究大鼠肺發(fā)育不同階段粘著斑激酶(focaladhesionkinase，F(xiàn)AK)表達變化，探討FAK在肺發(fā)育過程中可能發(fā)揮的作用。 [方法]于大鼠肺發(fā)育不同階段(胚胎18、20和21d及出生后1、4、7、10和21d)留取大鼠肺組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)法和Westernblot技術(shù)對FAK蛋白表達進行定位、定量檢測，采用RT-PCR方法對FAKmRNA表達水平進行半定量

2、分析。 [結(jié)論]FAK在肺發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，它可能與氣道上皮發(fā)育、呼吸管腔和毛細血管網(wǎng)形成密切相關(guān)，并參與肺泡上皮細胞增殖、分化。 第二部分85％高氧對早產(chǎn)大鼠肺組織FAK表達的影響 [目的]建立高氧肺損傷動物模型，研究持續(xù)高氧暴露對新生大鼠肺組織中FAK表達的影響，探討FAK表達變化在新生大鼠高氧肺損傷發(fā)生、發(fā)展中可能的作用。 [方法]剖宮術(shù)取出孕21d大鼠作為早產(chǎn)鼠，將早產(chǎn)鼠置于85％高氧環(huán)境下

3、4d、7d和14d，各組均以空氣組早產(chǎn)鼠為對照，留取肺組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)法和Westernblot技術(shù)對肺組織FAK和磷酸化FAK(FAK-Tyr397)表達進行定位、定量檢測，采用RT-PCR方法對肺組織FAKmRNA表達水平進行半定量分析。 [結(jié)論]持續(xù)高氧暴露導(dǎo)致早產(chǎn)鼠FAK異常表達，參與了高氧肺損傷的發(fā)生和發(fā)展；FAK表達受抑制是導(dǎo)致正常肺泡化過程受阻以及不成熟肺組織損傷后異常修復(fù)的重要因素，其機制有可能與其抑制

4、肺泡上皮細胞增殖、分化，以及毛細血管形成有關(guān)。 第三部分FAK活化與高氧暴露下肺泡Ⅱ型細胞增殖、凋亡的關(guān)系探討 [目的]建立高氧細胞模型，研究高氧暴露對體外培養(yǎng)的胎鼠肺泡Ⅱ型細胞(AECⅡ)FAK表達的影響，并進一步探討FAK活化與高氧暴露下AECⅡ增殖、凋亡的相關(guān)性。 [方法]分離、培養(yǎng)19d～20d胎鼠AECⅡ，經(jīng)貼壁純化后隨機分為空氣組(Ⅰ)、高氧組(Ⅱ)，Ⅱ組在更換培養(yǎng)液后通入5L/min95％O2-5％

5、CO2高純混合氣，10min后密封。各組均置于培養(yǎng)箱(37℃，5％CO2)中，培養(yǎng)6h、12h、24h和48h后，收獲各組細胞，提取細胞總RNA和總蛋白，RT-PCR和Western-blot半定量分析各組培養(yǎng)細胞FAKmRNA及FAK蛋白、FAK-Tyr397蛋白表達強度，并利用Annexin-V和PI雙標(biāo)法經(jīng)流式細胞儀檢測高氧暴露下AECⅡ發(fā)生凋亡的時空變化。 選擇高氧12h為研究點，將貼壁純化后AECⅡ隨機分為4組：①空氣

6、組②高氧組③空氣+Matrigel組④高氧+Matrigel組，③和④組在AECⅡ分離純化后接種在Matrigel包被的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板上，提取細胞總RNA和總蛋白，RT-PCR和Westernblot半定量分析人工重組基底膜Matrigel膠對FAK蛋白、FAK-Tyr397蛋白和FAKmRNA表達的影響，以了解Matrigel膠對FAK活性的調(diào)節(jié)作用。 為了解高氧暴露下AECⅡ增殖、凋亡與FAK活化、阻斷的相關(guān)性，將分離純化后

7、AECⅡ隨機分為6組：①空氣組②高氧組③空氣+Matrigel組④高氧+Matrigel組⑤空氣+Matrigel+(RGD+YIGSR)組⑥高氧+Matrigel+(RGD+YIGSR)組，F(xiàn)AK阻斷劑RGD和YIGSR濃度為50ug/ml，用PCNA免疫細胞化學(xué)法和TUNEL法分別檢測FAK阻斷和激活狀態(tài)下AECⅡ增殖和凋亡狀況。 [結(jié)論]①高濃度氧誘導(dǎo)AECⅡ凋亡和壞死，抑制AECⅡFAK的表達，F(xiàn)AK表達抑制是AECⅡ凋

8、亡和壞死的重要原因之一。②Matrigel膠具有抑制AECⅡ凋亡、促進AECⅡ增殖作用，對高氧暴露下AECⅡ具有保護作用，且與其促進FAK表達和活化有關(guān)。 第四部分FAK活化抑制高氧暴露下AECⅡ凋亡、促進其增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制 [目的]研究高氧暴露下AECⅡPI-3K(磷脂酰肌醇3—激酶)、Akt(絲氨酸/蘇氨酸激酶)、磷酸化Akt(p-AktSer473)、GSK3(糖原合成酶3)和磷酸化Bad(p-BadSer136

9、)表達變化，探討FAK活化促進AECⅡ增殖、抑制AECⅡ凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。 [方法]將貼壁純化后AECⅡ隨機分為4組：①空氣+Matrigel膠；②高氧+Matrigel膠；③空氣+Matrigel膠+(RGD+YIGSR)組；④高氧+Matrigel膠+(RGD+YIGSR)組。培養(yǎng)12h后收集各組細胞，提取總蛋白，Westernblot半定量分析各組培養(yǎng)細胞PI-3K蛋白表達強度。為檢測PI-3K下游分子，增設(shè)⑤空氣+Mat

10、rigel膠+LY294002；⑥高氧+Matrigel膠+LY294002，PI-3K阻斷劑LY294002濃度為25umol/L，Westernblot半定量分析各組培養(yǎng)細胞Akt和p-AktSer473蛋白表達強度。Akt下游分子GSK3和p-BadSer136表達強度均采用流式細胞儀進行檢測。 [結(jié)論](1)FAK—PI-3K/Akt信號通路參與高氧暴露下AECⅡ凋亡和增殖的調(diào)控，Matrigel膠活化FAK后，可通過P