I型成纖維細胞生長因子受體(FGFR1)在腭發(fā)育中的作用機制研究.pdf

1、目的:
　　 FGF對于腭形成極為重要，通過激活FGFR酪氨酸激酶調(diào)節(jié)著腭的發(fā)育。FGF和FGFR基因的突變都與腭裂相關(guān)。FGF信號在腭發(fā)育中的多種機制研究主要集中在上皮FGFR2，盡管FGFR1在腭間質(zhì)表達且Fgf1突變與腭裂相關(guān)，但是對神經(jīng)嵴細胞來源的間質(zhì)FGFR1如何調(diào)節(jié)腭形成并不是非常清楚。本課題通過特異性敲除神經(jīng)嵴細胞Fgfr1，以此來研究FGFR1在腭發(fā)育和腭裂形成中的重要作用機制。
　　 方法:
　　

2、 1.Wnt1Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與Fgfr1flox小鼠交配，獲得不同胚胎時期組織樣品進行基因型檢測。選擇帶有ROSA26報告基因的E10.5胚胎組織進行LacZ染色，比較野生型和Fgfr1敲除組早期額鼻突、上頜突和下頜突細胞生長變化。
　　 2.選擇E13.5，E14.5，E15.5各個時間點對照組和Fgfr1敲除組胚胎進行H&E染色，觀察不同時期腭突形態(tài)的變化。同時對E12.5、E13.5和E14.5組織進行細胞增殖檢測，分

3、析不同時期腭突上皮細胞和間質(zhì)細胞表現(xiàn)。應(yīng)用TUNEL試劑盒來分析腭突細胞凋亡的改變。由于Wnt1Cre是在神經(jīng)嵴細胞特異性表達，X-gal染色以此來判斷腭突細胞來源。同時檢測Vimentin在對照組和Fgfr1cKO組腭突細胞中的表達。
　　 3.分離E13.5天胚胎腭突，在8μm孔徑過濾膜上相互靠近進行體外培養(yǎng)，2天后收取組織，在組織解剖鏡下拍照并進行石蠟包埋H&E染色，觀察組織體外融合情況。利用免疫熒光的方法，檢測腭突上皮細

4、胞相關(guān)抗體的表達。P63是檢測腭突上皮完整性的標志之一，E-cadherin是上皮細胞的標記物，Smad1/5/8是BMP信號通路下游分子。通過檢測這幾種抗體的表達可以顯示腭突發(fā)育過程中結(jié)構(gòu)完整性及可能的信號通路。提取腭突RNA進行Shh、BMP和Wnt信號通路相關(guān)分子檢測。
　　 結(jié)果:
　　 1.我們通過Wnt1Cre的轉(zhuǎn)基因鼠與Fgfr1flox小鼠雜交，特異性敲除神經(jīng)嵴細胞Fgfr1導致了小鼠唇腭裂及其他嚴重頭面

5、部缺陷。在E10.5天時，對照組與敲除組外形相同，除了額鼻突和上頜突稍微減小。ROSA26報告基因追蹤結(jié)果表明，與野生型相比，參與額鼻突、上頜突和下頜突形成的神經(jīng)嵴細胞在敲除鼠中明顯減少。在E14.5天和新生小鼠中發(fā)現(xiàn)，敲除鼠中線鼻突丟失，且表現(xiàn)出第一硬腭和第二硬腭裂還有唇裂。對照組和敲除組胚胎冠狀面LacZ染色切片顯示，ROSA報告基因分布區(qū)域及神經(jīng)管形成沒有差異。
　　 2.通過E13.5、E14.5和E15.5胚胎的H&E

6、染色觀察顯示，在E14.5天時對照組第二硬腭前段已經(jīng)開始融合過程，內(nèi)緣上皮細胞已經(jīng)形成，同時腭突后段已經(jīng)完成了上抬，且仍保持繼續(xù)生長。Fgfr1cKO組腭突前后兩段都仍然是向下方向生長，無法上抬及融合。免疫熒光檢測E12.5、E13.5和E14.5胚胎腭突BrdU表達，結(jié)果顯示E12.5和E13.5敲除組腭突前端上皮細胞和后端間質(zhì)增殖細胞減少，前端間質(zhì)和后端上皮細胞增殖沒有區(qū)別。Fgfr1cKO組E14.5前端上皮和間質(zhì)細胞還有后端上皮

7、細胞增殖比對照組明顯增加。TUNEL凋亡檢測結(jié)果表明在E14.5胚胎對照組中嵴上皮細胞(MEE)凋亡比Fgfr1cKO組增加。
　　 3.分離腭突體外培養(yǎng)2d，在對照組和Fgfr1cKO組中組織均可以融合。體外融合的腭突H&E染色顯示內(nèi)皮中線縫上皮細胞消失，但是兩腭突間沒有完全被間質(zhì)細胞填充，仍有一定間隙。ROSA26報告基因追蹤顯示對照組腭突主要是由Wnt1 Cre表達的顱神經(jīng)嵴細胞組成。原位雜交結(jié)果顯示，與對照組相比Fgfr

8、1cKO組間質(zhì)細胞Fgfr1表達降低，上皮細胞Tgfβ3表達明顯減少。Vimentin抗體檢測對照組與Fgfr1 cKO組腭突均為陽性細胞。P63免疫組化結(jié)果提示敲除組前端上皮細胞不完整。對照組MEEs的E-cadherin染色模糊，F(xiàn)gfr1 cKO組中也有相似的現(xiàn)象。熒光定量PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)gfr1cKO胚胎在E10.5時Notch1和BMP4表達增加，Wnt1表達減少，而Wnt和BMP信號通路在E14.5的Fgfr1cKO組中都