低頻超聲輔助尿激酶溶栓治療大鼠腦梗死的作用機(jī)制及對MMP-9和TIMP-1表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景:腦梗死是臨床常見病多發(fā)病,具有高發(fā)生率、高致殘率、高死亡率的特點(diǎn),嚴(yán)重危害人類健康和增加社會(huì)及家庭的負(fù)擔(dān)。研究腦梗死的發(fā)病機(jī)制、尋求有效的治療方法,建立穩(wěn)定的、可重復(fù)的、符合人類血栓栓塞性腦梗死的動(dòng)物模型是十分必要的。常用的制作局灶性腦梗死模型的方法有線栓法、光化學(xué)誘導(dǎo)法等,這些模型能不同程度反映腦梗死的病理生理變化,但與人類卒中有很大不同。而血栓栓塞法制作的局灶性腦梗死模型更接近于人類缺血性卒中的病理過程。大腦中動(dòng)脈是腦梗死

2、的好發(fā)部位,其側(cè)枝循環(huán)不豐富,因此普遍認(rèn)為大腦中動(dòng)脈栓塞模型是局灶性腦缺血的標(biāo)準(zhǔn)模型。
　　 目的:建立符合人類血栓栓塞性腦梗死病理生理過程和適合用于溶栓研究的大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞動(dòng)物模型。
　　 方法:用健康成年Wistar雄性大鼠167只,體重280-320g。隨機(jī)抽取21只作為假手術(shù)組,其余的應(yīng)用自體血栓栓塞法制作大腦中動(dòng)脈閉塞動(dòng)物模型。模型制作:10％水合氯醛350mg/Kg腹腔麻醉,分離頸內(nèi)動(dòng)脈,頸外動(dòng)脈,頸總動(dòng)

3、脈,然后從頸外動(dòng)脈切口處逆行插入24號靜脈留置針,假手術(shù)組注入生理鹽水,其余組注入符合標(biāo)準(zhǔn)的血栓。大鼠蘇醒后,應(yīng)用NSS進(jìn)行神經(jīng)行為功能評分,大于7分為模型成功標(biāo)準(zhǔn)。將制模成功的大鼠隨機(jī)分為梗死組、尿激酶組、超聲+尿激酶組。尿激酶組在造模成功后3小時(shí)尾靜脈注射尿激酶1.5萬U,超聲+尿激酶組在造模成功后3小時(shí)尾靜脈注射尿激酶1萬U,同時(shí)頭顱部的相應(yīng)部位給予1:5,800KHZ、1.2w/cm2的超聲波照射30分鐘。梗死組于尾靜脈注射0.

4、4ml生理鹽水。24小時(shí)后每組分別進(jìn)行取材,紅四氮唑(TTC)染色,進(jìn)行腦梗死體積測定。每組選1只治療24小時(shí)后立即取腦,超微切片后,行透射電子顯微鏡檢查。
　　 結(jié)果:該研究共用wistar大鼠167只,其中假手術(shù)組21只,用于造模146只,造模成功共63只,造模成功率約43.2％,隨機(jī)分為梗死組、尿激酶組、超聲+尿激酶組各21只。造模成功的大鼠表現(xiàn)為:左側(cè)Horner征,角膜反射、驚恐反射、羽翼反射減弱或消失,右側(cè)肢體癱瘓,

5、爬行困難,不能直線爬行,原地繞圈,提起尾部時(shí)出現(xiàn)右上肢屈曲上抬,平衡障礙等,NSS評分>7分,認(rèn)為造模成功。假手術(shù)組動(dòng)物給藥前后評分均為0；梗死組給藥后24小時(shí)NSS評分為9.19±0.93,與給藥前9.28±1.14比較,未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。假手術(shù)組均未見梗死灶,梗死組均在左側(cè)大腦半球可見不被染色的梗死灶,主要位于左側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū),以皮質(zhì)為主,基底節(jié)及海馬也有受累,腦梗死體積為94.90±11.09mm3。透射電鏡

6、顯示:假手術(shù)組神經(jīng)元無缺血表現(xiàn),核大而圓,細(xì)胞器完整,梗死組可見基底節(jié)和皮層廣泛神經(jīng)元壞死表現(xiàn),核膜溶解、消失,核碎裂；神經(jīng)元正常結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞。
　　 結(jié)論:通過頸外動(dòng)脈逆行注入符合標(biāo)準(zhǔn)的自體血栓可成功建立大鼠大腦中動(dòng)脈血栓栓塞性腦梗死動(dòng)物模型。病理觀察證實(shí)該模型符合人類腦梗死的基本特點(diǎn),是適合用于溶栓研究的可靠的動(dòng)物模型。
　　 研究背景:腦梗死病理過程包括腦缺血的炎癥反應(yīng),鈣超載,自由基損害,興奮性氨基酸毒性及缺血半

7、暗帶的神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡。急性腦梗死時(shí),腦組織缺血30-90分鐘后,不可逆的腦損傷即開始出現(xiàn),腦梗死最根本的治療措施是使閉塞的腦血管早期再通,在缺血腦組織出現(xiàn)不可逆損害之前及時(shí)恢復(fù)供血,因此早期和超早期溶栓治療可能是最有效,最有希望的治療方法。目前尿激酶和r-tPA靜脈溶栓是治療超早期腦梗死的主要方法之一,由于溶栓時(shí)間窗短,較高的出血危險(xiǎn)性,影響其在臨床方面的廣泛應(yīng)用。超聲溶栓是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù),低頻超聲通過其機(jī)械作用、熱

8、學(xué)作用、空泡化作用,協(xié)助藥物溶栓,已經(jīng)成為近幾年研究的熱點(diǎn)之一。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)主要是單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,其它許多細(xì)胞,如神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、星形細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞受到刺激后也能產(chǎn)生TNF-α。TNF-α是一種炎性細(xì)胞因子,生物學(xué)活性廣泛,在腦缺血時(shí)表達(dá)增加,增加血腦屏障通透性,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)和多形核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)。核轉(zhuǎn)錄因子(nucl

9、ear factorκB,NF-κB)是Rel蛋白家族中的一組轉(zhuǎn)錄因子,是由多肽鏈p50和p65二個(gè)蛋白亞基組成同源或異源性二聚體。NF-κB作為一種多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白,能調(diào)節(jié)多種炎癥因子的表達(dá)和細(xì)胞凋亡,在缺血中起了重要作用。
　　 目的:通過觀察應(yīng)用低頻超聲輔助尿激酶靜脈溶栓治療大鼠腦梗死前后TNF-α,NF-κB的變化,探討低頻超聲輔助尿激酶靜脈溶栓治療腦梗死過程中的作用機(jī)制。
　　 方法:應(yīng)用血栓栓塞法制備Wis

10、tar大鼠腦梗死模型,根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)平均分為3組(梗死組,尿激酶組,超聲+尿激酶組),每組21只。大鼠蘇醒后,采用NSS進(jìn)行神經(jīng)行為功能評分；尿激酶組在造模成功后3小時(shí)尾靜脈注射尿激酶1.5萬U,超聲+尿激酶組在造模成功后3小時(shí)尾靜脈注射尿激酶1萬U,同時(shí)頭顱部的相應(yīng)部位給予1:5,800KHZ、1.2W/cm2的超聲波照射30分鐘。梗死組于尾靜脈注射0.4ml生理鹽水。24小時(shí)后每組分別進(jìn)行灌注取材,采用TTC染色法測定腦梗死體積

11、,采用免疫組化法監(jiān)測TNF-α和NF-κB的表達(dá)。
　　 結(jié)果:每組大鼠均在治療前和治療24h后分別進(jìn)行NSS評分。假手術(shù)組動(dòng)物蘇醒后活動(dòng)正常,NSS評分均為0分；各組治療前評分差異不明顯(盧0.405,/50.05)；梗死組治療前后NSS評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.288,P＞0.05)；尿激酶組治療后24h評分明顯低于溶栓前(t=7.840,P＜0.01)；超聲+尿激酶組治療后評分明顯低于溶栓前(t=-11.176,P＜

12、0.01)。各組治療后評分有顯著差異(F=81.98,P＜0.01)；尿激酶組和超聲+尿激酶組評分顯著低于梗死組(q=12.387,q=17.633,P＜0.01),超聲+尿激酶組低于尿激酶組(q=5.246,P＜0.05)；三組梗死灶體積差異顯著(F=117.81,P＜0.01),梗死組的梗死灶體積為(94.90±11.09)mm3,主要位于左側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū),以皮質(zhì)為主,基底節(jié)及海馬也有受累；尿激酶組梗死灶體積為(59.24±8.

13、25)mm3,顯著小于梗死組(q=15.87 P<0.01)；超聲+尿激酶組梗死灶體積為(48.19±11.30)mm3,顯著小于梗死組(q=20.76 P＜0.01)與尿激酶組(q=4.89,P＜0.05)。三組TNF-α表達(dá)差異顯著(F=89.36,P＜0.01),尿激酶組和超聲+尿激酶組TNF-α表達(dá)顯著高于梗死組(q=18.001,14.004,P＜0.01),超聲+尿激酶組低于尿激酶組(q=3.997,P＜0.05)；三組NF

14、-κB表達(dá)差異顯著(F=34.89,P＜0.01),尿激酶組和超聲+尿激酶組NF-κB表達(dá)顯著高于梗死組(q=11.619,q=7.654P＜0.01),超聲+尿激酶組低于尿激酶組(q=3.966,P＜0.05)。
　　 結(jié)論:尿激酶在腦梗死超早期有肯定的溶栓作用。低頻超聲具有顯著的協(xié)助尿激酶溶栓作用,可以減少尿激酶用量,達(dá)到與大量尿激酶溶栓的同等效果。TNF-α與NF-κB共同在腦梗死后缺血損傷中起著重要作用。
　　

15、研究背景:基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs),MMPs是一類Zn2+離子依賴的蛋白水解酶,參與細(xì)胞外基質(zhì)的代謝。MMP-9又稱明膠酶-B,是基質(zhì)金屬蛋白酶的一種,主要由中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞合成與分泌。生理?xiàng)l件下MMP-9的活性受到嚴(yán)格的調(diào)控,當(dāng)其以酶原的形式從胞內(nèi)分泌到胞外后,經(jīng)酶解過程而激活。MMP-9可能降解血管外基質(zhì)(ECM)的關(guān)鍵成分如Ⅳ膠原,破壞血管,導(dǎo)致滲漏和破裂。在

16、腦缺血及溶栓治療過程中,MMP-9可能通過降解ECM,改變血管通透性,損傷血腦屏障,參與血管源性腦水腫、參與了溶栓引起的腦缺血/再灌注損傷、出血過程。
　　 目的:通過研究大鼠局灶性腦缺血應(yīng)用溶栓前后刪P-9及其抑制劑體TIMP-1表達(dá)的變化情況,探討MMP-9在腦梗死缺血損傷和溶栓后出血性轉(zhuǎn)化中的作用。
　　 方法:應(yīng)用血栓栓塞法制備Wistar大鼠腦梗死模型,分別給予尿激酶、尿激酶+低頻超聲治療,采用NSS評價(jià)治療前

17、后神經(jīng)功能,采用TTC測定腦梗死體積,采用免疫組化法監(jiān)測MMP-9和TIMP-1蛋白的表達(dá),應(yīng)用原位雜交法測定MMP-9和TIMP-1 mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:尿激酶組和超聲+尿激酶組MMP-9蛋白表達(dá)均顯著高于梗死組,超聲+尿激酶組低于尿激酶組。尿激酶組和超聲+尿激酶組MMP-9 mRNA表達(dá)均顯著高于梗死組,超聲+尿激酶組低于尿激酶組。尿激酶組和超聲+尿激酶組TIMP-1蛋白表達(dá)均顯著高于梗死組。超聲+尿激酶組高于尿激