新型高靈敏、高特異性電化學(xué)納米生物傳感器的構(gòu)建及應(yīng)用研究.pdf

1、脫氧核糖核酸(DNA)是遺傳信息的承擔(dān)者，是生物遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。生物機體的遺傳信息以密碼的形式編碼在DNA分子上。對人體、病毒和細(xì)菌核酸中特定堿基序列的檢測在疾病診斷、食品污染、法醫(yī)鑒定和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域都將會發(fā)揮越來越重要的作用。尤其是在分子水平檢測基因突變，為在任何疾病出現(xiàn)征兆前的可靠診斷提供了可能。 蛋白質(zhì)作為生命物質(zhì)基礎(chǔ)，與各種形式的生命活動緊密聯(lián)系在一起，它參與生命體的每一步反應(yīng)和活動，蛋白質(zhì)的定量測定是研究蛋白質(zhì)的

2、基礎(chǔ)，尤其對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能研究、人體營養(yǎng)健康研究、疾病診斷以及藥物、轉(zhuǎn)基因食品及臨床分析有重要意義。 生命科學(xué)的飛速發(fā)展對DNA和蛋白質(zhì)的檢測提出越來越高的要求，而現(xiàn)存的傳感器技術(shù)還在起步階段。開發(fā)出更靈敏，穩(wěn)定和簡便的DNA和蛋白質(zhì)檢測技術(shù)是目前生命科學(xué)研究的熱點所在。 本論文的目的就是利用納米金的優(yōu)異的電化學(xué)性能和納米磁性顆粒的順磁性，研究基于生物識別的高度專一性、高靈敏度的電化學(xué)生物傳感器，應(yīng)用于蛋白及核酸序列的

3、檢測，特別是在對單堿基突變基因序列的檢測中，為疾病的早期診斷提供新的、高靈敏的檢測方法。全文共有四個部分： 第一章緒論首先介紹了生物傳感器的基本原理、分類及其研究進(jìn)展。其中著重對電化學(xué)的DNA生物傳感器的設(shè)計，尤其是如何提高其靈敏度、特異性以及研究進(jìn)展做了分析與評述。接著綜述了核酸適體電化學(xué)生物傳感器的優(yōu)勢和應(yīng)用，對今后的發(fā)展方向和趨勢進(jìn)行了展望。最后簡述了納米材料在生物傳感器中的應(yīng)用。 第二章利用互補核酸雜交富集金膠實

4、現(xiàn)信號擴(kuò)增的特異性電化學(xué)適體傳感器用于檢測凝血酶的研究 本文成功構(gòu)建了一種利用互補核酸雜交富集金膠實現(xiàn)信號擴(kuò)增的特異性適體傳感器。以凝血酶蛋白為研究對象，利用凝血酶與其相對應(yīng)的兩核酸適體的高親和性及磁性納米顆粒的磁性分離技術(shù)設(shè)計了三明治結(jié)構(gòu)的電化學(xué)適體傳感器。再通過信標(biāo)金膠上過剩的核酸適體鏈與另一段標(biāo)記有金膠的互補核酸進(jìn)一步雜交，獲得金膠的選擇性聚集，實現(xiàn)信號擴(kuò)增。通過信號擴(kuò)增，此傳感器的靈敏度大大提高，其線性回歸方程為Y=0.

5、34085+0.11616X，對凝血酶蛋白的檢測下限可以達(dá)到4.52×10-15mol/L。該方法對凝血酶蛋白有很好的特異性，其他蛋白如溶菌酶和牛血清白蛋白的存在對于檢測沒有影響。此新型的納米適體傳感器制作簡單，檢測具有很高的特異性和靈敏度，并有望運用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域檢測凝血酶。 第三章基于硫代三聚氰酸和金納米顆粒形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)實現(xiàn)信號擴(kuò)增的超靈敏電化學(xué)適體傳感器檢測凝血酶蛋白的研究 硫代三聚氰酸是一種具有三個巰基星狀結(jié)構(gòu)的

6、分子。它能夠利用自身的巰基與金納米顆粒形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。本章利用金納米顆粒和硫代三聚氰酸形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)信號擴(kuò)增，創(chuàng)造性的構(gòu)建了超靈敏度和高度特異性的電化學(xué)適體傳感器。線性范圍為7.47×10-17mol/L-1.494×10-15mol/L。對凝血酶蛋白的檢測下限可以達(dá)到7.82 amol/L。對濃度為2.24×10-15mol/L樣品重復(fù)測定十次，測得其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為9.24％。該電化學(xué)適體傳感器對凝血酶蛋白有很好的特異性。其

7、他蛋白如溶菌酶和牛血清白蛋白對于檢測沒有影響。本文的研究成果，為蛋白與核酸適配體的基礎(chǔ)研究，診斷學(xué)及藥物研制提供了相關(guān)信息，有助于發(fā)展新型適體傳感器，為研究蛋白與其對核酸適配體作用提供了新思路。 第四章基于金納米顆粒選擇性聚集實現(xiàn)信號擴(kuò)增、特異性提高的電化學(xué)生物傳感器檢測p53基因的研究 本文首次利用金納米顆粒的聚集實現(xiàn)信號放大作用，構(gòu)建超靈敏和高度特異性的電化學(xué)DNA傳感器，用于人類p53腫瘤抑制劑基因的研究。在實驗中

8、，根據(jù)p53基因的序列設(shè)計并合成了能特異性檢測p53腫瘤抑制劑基因的二段探針，在一段探針上固定磁性顆粒以捕獲并富集目標(biāo)DNA，同時在另一段探針上標(biāo)記金納米顆粒作為檢測信標(biāo)。另外，通過硫代三聚氰酸和金納米顆粒的自組裝作用，形成金納米顆粒和硫代三聚氰酸的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，獲得金納米顆粒的選擇性聚集，實現(xiàn)信號擴(kuò)增。用此法檢測得到的目標(biāo)野生型DNA，最低檢測限為2.24×10-17mol/L。同時我們研究了不同的探針序列，對p53野生型和突變型一堿基錯