新型高靈敏生物酶活性電化學(xué)生物傳感研究.pdf

1、生物酶和生物小分子是維持動(dòng)植物體內(nèi)新陳代謝不可缺少的重要物質(zhì)。幾乎所有細(xì)胞活動(dòng)進(jìn)程都需要酶的參與，它是生物體內(nèi)新陳代謝的催化劑，只有酶存在，生物體內(nèi)才能進(jìn)行各項(xiàng)生化反應(yīng)，從而維持生物體的各項(xiàng)活動(dòng)正常進(jìn)行。如果生物體內(nèi)酶缺乏或者合成障礙就會(huì)導(dǎo)致疾病甚至死亡。因此，運(yùn)用生物傳感器檢測(cè)生物體內(nèi)的酶活性具有重要意義。電化學(xué)生物傳感器是同時(shí)具備電化學(xué)分析方法靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)和生物學(xué)特異性優(yōu)勢(shì)的一類傳感器。同時(shí)，電化學(xué)生物傳感器設(shè)計(jì)比較簡(jiǎn)單，并且容易

2、實(shí)現(xiàn)，其檢測(cè)成本相對(duì)較低。本論文主要運(yùn)用電化學(xué)生物傳感器對(duì)酶活性及生物小分子進(jìn)行了檢測(cè)，分為以下三部分。
　　第一部分基于金納米粒子信號(hào)放大和伴刀豆球蛋白A特異性生物結(jié)合葡萄糖從而取代Con A結(jié)合位點(diǎn)上的β-巰基環(huán)糊精，建立了葡萄糖電化學(xué)檢測(cè)新方法。β-巰基環(huán)糊精既可以連接與玻碳電極表面通過共價(jià)鍵結(jié)合的伴刀豆球蛋白A，又可以連接接有硫堇的金納米粒子。當(dāng)向體系中加入D-葡萄糖時(shí)，由于加入的D-葡萄糖與β-巰基環(huán)糊精競(jìng)爭(zhēng)伴刀豆球蛋白

3、A的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致連接有硫堇和β-巰基環(huán)糊精的金納米粒子脫離電極表面致使硫堇的電化學(xué)信號(hào)降低，從而得到了一個(gè)穩(wěn)定的電化學(xué)傳感平臺(tái)。本方法的線性范圍是5.0×10-7M到1.55×10-5M并且檢出限為2.22×10-7M(3σ)。
　　第二部分提出了一種基于λ核酸外切酶(λExo)切割信號(hào)放大電化學(xué)雙信號(hào)檢測(cè)T4多核苷酸激酶(PNK)活性的新穎、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確方法。當(dāng)PNK和三磷酸腺苷(ATP)同時(shí)存在時(shí)，DNA的5'羥基端就會(huì)被磷酸

4、化，若被磷酸化的磷?；梦挥贒NA雙鏈的一端則會(huì)被λExo識(shí)別水解，釋放出另一條DNA鏈形成G-四聯(lián)體-氯化鐵紅素(hemin)開信號(hào)探針，而標(biāo)記二茂鐵的探針則會(huì)減少，從而實(shí)現(xiàn)了雙信號(hào)放大。本實(shí)驗(yàn)所提出檢測(cè)PNK活性方案的檢出限為0.02U/mL(3σ)。同時(shí)，PNK的兩種重要抑制劑硫酸銨和磷酸二氫鈉都能夠得到有效篩選。
　　第三部分提出了一種基于甲基化響應(yīng)的核酸外切酶Ⅲ輔助信號(hào)放大高靈敏檢測(cè)Dam甲基轉(zhuǎn)移酶活性的新方法。甲基轉(zhuǎn)

5、移酶和核酸內(nèi)切酶與包含有甲基轉(zhuǎn)移酶識(shí)別位點(diǎn)的發(fā)卡1(HP1)反應(yīng)后釋放出能與標(biāo)記亞甲基藍(lán)的發(fā)卡2(HP2)雜交的單鏈DNA片段。然后HP2上原來(lái)不能被核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)消化的3'端被激活，從而將標(biāo)記有亞甲基藍(lán)的單核苷酸和與其互補(bǔ)的DNA片段釋放出來(lái)。釋放的DNA互補(bǔ)鏈能夠與另外一個(gè)HP2相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了信號(hào)的放大。由于亞甲基藍(lán)標(biāo)記的單核苷酸帶有微弱的負(fù)電荷并且具有更小的尺寸，所以很容易擴(kuò)散到帶有負(fù)電荷的氧化銦錫(ITO)電極表面