SGK1在早期糖尿病腎病中作用的探索性研究.pdf

1、第一部分:血清和糖皮質(zhì)激素誘導的蛋白激酶在高糖誘導的人類腎小管上皮細胞中的表達 目的:研究高糖環(huán)境下人類近端腎小管上皮細胞(HKC)中血清和糖皮質(zhì)激素誘導的蛋白激酶(SGK)3種亞型SGK1，SGK2和SGK3的表達，并探討其在介導高糖致腎小管上皮細胞過度合成細胞外基質(zhì)(ECM)中的作用。 方法:將HKC分為三組：1)正常對照組(NG組，含5.5mmol/LD-葡萄糖)；2)高糖組(HG組，含25mmol/LD-葡萄糖

2、)；3)滲透壓對照組(MG組，含19.5mmol/L甘露醇和5.5mmol/LD-葡萄糖，終濃度25mmol/L)分別刺激2h和8h，采用RT-PCR方法和Westernblot方法檢測SGK1，SGK2，SGK3mRNA水平和SGK1蛋白水平的表達，ELISA方法和間接免疫熒光方法檢測培養(yǎng)液中和HKC胞漿內(nèi)纖連蛋白(FN)的含量。 結果:HKC細胞中存在SGK1，SGK2和SGK3的表達。高糖刺激下，SGK1，SGK2，SGK

3、3mRNA和SGK1蛋白表達明顯升高(P＜0.01)；同時伴有HKCFN合成和分泌的增加，這與SGK上調(diào)存在一定聯(lián)系。 結論:高糖能促進人近端腎小管上皮細胞SGK1，SGK2和SGK3的表達，并可能通過SGK1，SGK2和SGK3介導的信號轉導途徑促進細胞外基質(zhì)積聚，可能在糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮致病作用。 第二部分:SGK1超表達對人足細胞纖連蛋白表達的影響 目的:研究高糖刺激對人足細胞SGK1表達的影

4、響，以及SGK1超表達和滅活條件下，足細胞纖連蛋白的分泌水平，從正反兩方面揭示SGK1在誘導足細胞ECM聚集，引發(fā)糖尿病腎病腎纖維化過程中的作用。 方法:高糖刺激人足細胞8h，Westernblot方法檢測SGK1蛋白水平的表達。利用構建好的SGK1激活型質(zhì)粒(pIRES2-EGFP-SGK1SD)，滅活型質(zhì)粒(pIRES2-EGFP-SGK1KN)和空載體(pIRES2-EGFP)轉染人的足細胞，然后給予高糖刺激。免疫熒光方法

5、和Westernblot方法檢測轉染前后足細胞合成和分泌纖連蛋白的水平，以及高糖刺激對它的影響。 結果:人足細胞中存在SGK1的表達，高糖刺激后SGK1表達上調(diào)(P＜0.01)。SGK1SD轉染的足細胞FN分泌明顯增加，再予高糖刺激FN上調(diào)并不明顯；相反，SGK1KN轉染的足細胞中FN分泌明顯減少(P＜0.01)，高糖刺激下FN表達增加(P＜0.01)；對照組空載體轉染的細胞受高糖刺激后FN表達亦顯著上調(diào)(P＜0.01)。

6、 結論:SGK1參與了高糖誘導的人足細胞FN的合成，可能在糖尿病腎病早期足細胞的受損活化過程中發(fā)揮了重要作用。 第三部分:SGK1基因敲除鼠早期糖尿病腎病腎生理改變的研究 目的:追蹤檢測早期糖尿病腎病中SGK1基因敲除鼠腎臟生理特征的改變，進一步闡明SGK1的功能以及SGK1在早期糖尿病腎病腎纖維化中發(fā)揮的作用。 方法:采用定量PCR方法檢測6對野生型(WT)鼠和基因敲除鼠(KO)腎臟SGK2和SGK3的表達。

7、將野生型(sgk+/+)和SGK1基因敲除鼠(sgk-/-)隨機分為正常對照組和糖尿病模型組，制作STZ誘導的Ⅰ型糖尿病腎病模型，共分以下4組：①sgk+/+正常對照組(WT-NC組，n=4)；②sgk+/+糖尿病組(WT-DC組，n=6)；③sgk-/-正常對照組(KO-NC組，n=4)；④sgk-/-糖尿病組(KO-DC組，n=6)。定期采血，作代謝箱，收集糖尿病8周病程不同時間點的血、尿標本用于血、尿電解質(zhì)(Na+，K+，Ca2+

8、)，血糖和血紅蛋白，尿量和尿滲透壓，腎小球濾過率以及尿總蛋白和白蛋白的檢測。處死后稱取腎臟重量，計算腎重指數(shù)。 結果:sgk-/-鼠腎臟SGK2和SGK3的表達與sgk+/+鼠無明顯差異。WT-DC組和KO-DC組血Na+，K+，Ca2+濃度與相應NC組無明顯差異，但血糖和血紅蛋白均較相應NC組明顯升高(P＜0.01)。WT-DC組和KO-DC組尿Na+、K+、Ca2+、尿量、腎小球濾過率、尿總蛋白含量、尿白蛋白含量以及腎重指數(shù)

9、均較相應NC組顯著升高(P＜0.01)，尿滲透壓明顯降低(P＜0.01)。更為重要的是，KO-DC組尿總蛋白和尿白蛋白含量均明顯低于WT-DC組(P＜0.01)，其他參數(shù)兩組未見明顯差異。 結論:SGK1基因敲除后，SGK另外兩種亞型SGK2和SGK3表達沒有代償性上調(diào)，它們可能在在生命體中扮演了不同的角色。SGK1基因敲除可減少早期糖尿病腎病中蛋白尿的產(chǎn)生，對腎臟是一種保護性作用，從體內(nèi)直接證實了SGK1參與了早3期糖尿病腎病