高強(qiáng)度聚焦超聲消融對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移影響的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SD幼鼠模型的制備
　　目的:通過(guò)直視注射法將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞接種到幼年SD大鼠左側(cè)腎上腺區(qū)腎筋膜內(nèi)，建立人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SD幼鼠模型，為后期實(shí)驗(yàn)操作提供動(dòng)物模型支持。
　　方法:體外培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞株，采用開(kāi)腹直視注射法將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞接種到幼年SD大鼠左側(cè)腎上腺區(qū)腎筋膜內(nèi)，接種1～3×107/ml的單細(xì)胞懸液0.2ml。在腫瘤接種后第5天開(kāi)始，定期B超、彩色多

2、普勒血流成像檢查，觀察腫瘤影像學(xué)表現(xiàn)，腫瘤平均體積變化并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線;在腫瘤接種后第7天，隨機(jī)處死荷瘤鼠，進(jìn)行大體解剖和病理學(xué)檢查，HE染色觀察腫瘤組織形態(tài)學(xué)并采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤特異性標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇酶(Neurone specific enolase，NSE)的表達(dá);判斷腫瘤接種成功率。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果:神經(jīng)母細(xì)胞瘤SD幼鼠模型成功率高達(dá)100％(35/35)，本組

3、發(fā)生全身轉(zhuǎn)移且伴有明顯惡病質(zhì)體征的SD幼鼠3只，其余32只為接種部位局部腫瘤生長(zhǎng)。種瘤接種5天后B超可清晰定位觀察腫瘤，并彩色多普勒血流成像顯示腫瘤邊緣血供豐富;隨后定期B超監(jiān)測(cè)提示，接種9～12天腫瘤生長(zhǎng)迅速，17天左右腫瘤開(kāi)始縮小;2只荷瘤鼠在腫瘤接種1個(gè)月后發(fā)生腫瘤消退，其均在3個(gè)月后發(fā)生腫瘤消退。病理組織學(xué)可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞排列紊亂呈團(tuán)巢狀，瘤細(xì)胞呈圓形、卵圓形或不規(guī)則形，可見(jiàn)較多病理性核分裂相。免疫組織化學(xué)檢測(cè)腫瘤組織NSE陽(yáng)性表達(dá)

4、率為100％。
　　結(jié)論:成功建立人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SD幼鼠模型，成瘤時(shí)間短且腫瘤血供豐富。該模型制備簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、成功率高且易于觀察，為腫瘤細(xì)胞在正常免疫機(jī)體內(nèi)生長(zhǎng)的生物學(xué)特性打下良好的基礎(chǔ)，為局部腎上腺區(qū)腫瘤的物理治療學(xué)相關(guān)研究提供一個(gè)經(jīng)濟(jì)理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。
　　第二部分、HIFU消融對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SD幼鼠模型腫瘤轉(zhuǎn)移的影響
　　目的:探討HIFU消融人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SD幼鼠模型后能否抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生及其具體作用機(jī)制

5、。
　　方法:建立人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SD幼鼠模型，接種后第7～9天腫瘤最長(zhǎng)徑約1.0～1.5cm，將荷瘤鼠隨機(jī)分為HIFU治療組和手術(shù)治療組，并建立正常對(duì)照組。于治療第3天、第14天、第28天分別取靶區(qū)腫瘤組織（HIFU組）、腫瘤邊緣皮膚肌肉組織和其他鄰近器官（腎臟、腎上腺、脾、肝、腸管、肺臟等），解剖及病理HE染色觀察腫瘤的組織學(xué)改變，比較腫瘤治愈情況及腫瘤轉(zhuǎn)移病灶情況;于治療后第3天、第1周、第2周、第3周和第4周分別進(jìn)行B超和彩

6、色多普勒血流成像監(jiān)測(cè)觀察腫瘤消融情況（HIFU組）、瘤體血流灌注情況及腫瘤轉(zhuǎn)移病灶情況;并于治療前，治療后第3天、第14天、第28天分別采集外周血，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測(cè)定荷瘤鼠外周血T淋巴細(xì)胞及其亞群(CD3+、CD4+、CD8+)的變化，并于正常對(duì)照組比較;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清VEGF的變化，并于正常對(duì)照組比較。以上所得數(shù)據(jù)根據(jù)資料不同分別采用x2檢驗(yàn)，方差分析等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果: HIFU組與

7、手術(shù)組比較，腫瘤治愈率（88.9％比48.9％）增高(P＜0.01)。大體解剖及病理組織學(xué)觀察分析，HIFU治療組腫瘤轉(zhuǎn)移率低于手術(shù)治療組，每組荷瘤鼠在治療后3天、2周及4周腫瘤轉(zhuǎn)移率分別為6.7％(1/15)比46.7％(7/15)，20％(3/15)比60％(9/15)，0(0/15)比46.7％(7/15)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01)。B超和彩色多普勒血流成像監(jiān)測(cè)提示:HIFU治療后，CDFI

8、在靶區(qū)未測(cè)及任何血流信號(hào)，并于治療后3～7天B超示腫瘤內(nèi)部可見(jiàn)形狀不規(guī)則，大小不等的小片狀無(wú)回聲區(qū)，或點(diǎn)簇狀高回聲鈣化影;HIFU治療組有4只(4/45，8.9％)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶;手術(shù)治療組有20只發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶(20/45，44.4％)，兩組差異有顯著性（P＜0.01）。與治療前比較，HIFU治療后荷瘤鼠外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞(P＜0.05)增加，CD4+/CD8+比值(P＜0.05）升高，CD8+T淋巴細(xì)胞(P＜0.05)降

9、低，手術(shù)組治療前后各指標(biāo)均無(wú)明顯差異(P＞0.05); HIFU治療組和正常對(duì)照組CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞（P＜0.05），CD4+/CD8+(P＜0.05)比值明顯高于手術(shù)組，CD8+T淋巴細(xì)胞(P＜0.05)低于手術(shù)組，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HIFU組與正常對(duì)照組比較，各指標(biāo)均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。與治療前比較，HIFU治療荷瘤鼠后血清VEGF蛋白的表達(dá)量明顯降低，且在術(shù)后3天、2周、四周其血清VEGF蛋白表達(dá)量分別低于

10、同期手術(shù)組，尤其是在2周、四周時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與治療前比較，手術(shù)組荷瘤鼠血清VEGF蛋白的表達(dá)量降低，在第14天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與正常對(duì)照組比較，HIFU組與手術(shù)組荷瘤鼠在治療前血清VEGF蛋白表達(dá)量明顯增高（P＜0.01）;HIFU治療后，血清VEGF蛋白表達(dá)量較正常組增高，但僅在治療后第三天有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);手術(shù)治療后血清VEGF蛋白表達(dá)量較正常組明顯增高(P＜0.01)。