DNA甲基化對(duì)HNF4α表達(dá)的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、[研究背景及目的]：
　　 原發(fā)性肝細(xì)胞癌(以下簡(jiǎn)稱肝癌)是世界上最常見的惡性腫瘤之一。已明確的致病因素包括：乙肝和丙肝病毒感染、肝硬化、大量飲酒、黃曲霉素?cái)z入等，但導(dǎo)致肝癌形成和進(jìn)展的分子生物學(xué)機(jī)制還不完全明確。最近研究表明，在肝癌形成和發(fā)展過(guò)程中，DNA甲基化異常發(fā)揮著重要作用。
　　 肝細(xì)胞核因子4α(Hepatocytenuclearfactor-4α，HNF4α)是肝細(xì)胞核因子受體超家族中的一員，具有參與肝細(xì)胞

2、白蛋白合成、藥物解毒、能量代謝、膽汁酸合成和脂肪代謝等重要功能。HNF4α共有9種亞型，分別由兩個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，其中HNF4α1－6(統(tǒng)稱為HNF4αP1)由P1啟動(dòng)子調(diào)控轉(zhuǎn)錄，P2啟動(dòng)子調(diào)控轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生HNF4α7-9(統(tǒng)稱為HNF4αP2)。
　　 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)是一個(gè)多能性的細(xì)胞因子，在組織和器官的發(fā)育、纖維化以及細(xì)胞增殖、分化、生存和凋亡方面等

3、發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。TGF-β1對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有著雙向調(diào)節(jié)作用，腫瘤早期TGF-β1可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，晚期則促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，包括增加腫瘤的侵襲能力和促進(jìn)EMT的形成。研究表明，TGF-β1在肝細(xì)胞分化和肝臟發(fā)育的不同階段都起著非常重要的作用。
　　 本研究旨在探討肝癌細(xì)胞中DNA甲基化對(duì)HNF4α表達(dá)的影響及其在TGF-β1調(diào)節(jié)HNF4α表達(dá)中的作用。
　　 [實(shí)驗(yàn)方法]：
　　 一、人肝癌標(biāo)本及肝癌細(xì)胞株中HNF4

4、αP1和HNF4αP2表達(dá)的檢測(cè)
　　 取20例手術(shù)切除人肝癌標(biāo)本，以相應(yīng)癌旁組織為對(duì)照，利用RealtimePCR檢測(cè)HNF4αP1、HNF4αP2的表達(dá)。
　　 RealtimeRT-PCR檢測(cè)Hep3B、HepG2、Huh－7、YY等10種不同人肝癌細(xì)胞株中HNF4αP1、HNF4αP2表達(dá)。
　　 二、P1、P2啟動(dòng)子甲基化程度的檢測(cè)
　　 選取HNF4αP1、HNF4αP2表達(dá)差異較大的幾種人肝

5、癌細(xì)胞株，利用亞硫酸鹽測(cè)序法(bisulfitesequencingPCRBSP)檢測(cè)P1啟動(dòng)子區(qū)基因片段甲基化程度，用甲基化特異性PCR(MethylmionSpecificPCRMSP)法檢測(cè)P2啟動(dòng)子區(qū)基因片段甲基化程度。
　　 三、5-AZA－CdR處理人肝癌細(xì)胞株后HNF4αP1、HNF4αP2表達(dá)的檢測(cè)
　　 將人肝癌細(xì)胞株FOCUS以2×105/孔接種于6孔板，在含不同濃度5－脫氧雜氮胞苷(5-aza－2’

6、－deoxycytidine，5-AZA-CdR)(0.1μM、1μM、2.5μM)DMEM(含10％胎牛血清)中培養(yǎng)，設(shè)置空白對(duì)照組，每24小時(shí)更換相應(yīng)培養(yǎng)基。37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h后，收集細(xì)胞，BSP法檢測(cè)P1啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度，RealtimePCR檢測(cè)HNF4αP1、HNF4αP2表達(dá)。
　　 四、TGF-β1對(duì)人肝癌細(xì)胞株中HNF4α表達(dá)的調(diào)控
　　 將人肝癌細(xì)胞株Hep3B、HepG2、Huh－7、

7、SMMC-7721、BEL－7405、FOCUS以7×105/FL接種于6孔板，用相應(yīng)培養(yǎng)基(含1％胎牛血清)將TGF-β1稀釋，使其在培養(yǎng)孔的終濃度為2ng/ml，設(shè)置空白對(duì)照組，每24小時(shí)更換相應(yīng)培養(yǎng)基。37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h后，收集細(xì)胞，RealtimePCR檢測(cè)HNF4αP1的表達(dá)。
　　 五、DNA甲基化在TGF－β2調(diào)節(jié)HNF4αP1表達(dá)中的作用
　　 將人肝癌細(xì)胞株FOCUS以5x105/孔接種于

8、6孔板，分為A、B、C、D四組，A組為空白對(duì)照組；B組1μM5-AZA－CdR處理6天；C組自第4天予2ng/mlTGF-β1處理，連續(xù)作用3天；D組前3天予1μM5-AZA-CdR處理，后3天予2ng/mlTGF-β1處理。每24小時(shí)更換相應(yīng)培養(yǎng)基。37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6d后，收集細(xì)胞，RealtimePCR檢測(cè)HNF4αP1的表達(dá)。
　　 六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，結(jié)果以

9、-X±S表示。多組間采用One-WayANOVA分析，方差齊性則采用非參數(shù)檢驗(yàn)；P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果]：
　　 一、人肝癌標(biāo)本中HNF4αP1表達(dá)明顯下降HNF4αP2表達(dá)明顯上升
　　 RealtimePCR檢測(cè)20例肝癌與癌旁組織中HNF4αP1的表達(dá)量，結(jié)果顯示：20例臨床肝癌標(biāo)本中，13例肝癌組織的HNF4αP1表達(dá)低于其癌旁組織(P<0.05)，4例肝癌組織的HNF4αP1表

10、達(dá)與癌旁組織無(wú)顯著差別，另外3例肝癌組織的HNF4αP1表達(dá)高于癌旁組織(P<0.05)。
　　 RealtimePCR檢測(cè)20例肝癌與癌旁組織中HNF4αP2的表達(dá)量，結(jié)果顯示：13例肝癌組織的HNF4αP2表達(dá)高于癌旁組織(P<0.05)，2例肝癌組織的HNF4αP2表達(dá)與癌旁組織無(wú)顯著差別，另外5例肝癌組織的HNF4αP2表達(dá)低于癌旁組織(P<0.05)。
　　 RealtimePCR分別檢測(cè)肝癌細(xì)胞株Hep3B、

11、HepG2、Huh-7、YY、MHCC-H、MHCC-L、SMMC-7721、BEL-7405和FOCUS中HNF4αP1、HNF4αP2的表達(dá)，結(jié)果顯示：HNF4αP1、HNF4αP2在Hep3B、HepG2、Huh-7中表達(dá)相對(duì)高，在SMMC-7721、BEL-7405、FOCUS中表達(dá)相對(duì)低，其中Hep3B、HepG2、Huh-7中HNF4αP1平均表達(dá)量高于SMMC-7721、BEL-7405、FOCUS900多倍(P<0.05

12、)，而HNF4αP2在Hep3B、HepG2、Huh-7中平均表達(dá)量也較SMMC-7721、BEL-7405、FOCUS高出近300倍(P<0.05)。
　　 二、HNF4αP1、HNF4αP2啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與其表達(dá)呈負(fù)相關(guān)
　　 選取HNF4αP1、HNF4αP2表達(dá)差異較大的幾種人肝癌細(xì)胞株，分別在HNF4α兩個(gè)啟動(dòng)子區(qū)各取一基因片段，檢測(cè)其甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示：BSP檢測(cè)HNF4αP1、HNF4αP2表達(dá)較高的幾

13、種人肝癌細(xì)胞株如Hep3B、HepG2、Huh-7中P1的甲基化程度分別為3.6％、3％、2％，而HNF4αP1、HNF4αP2表達(dá)較低的幾種人肝癌細(xì)胞株如SMMC-7721、BEL-7405、FOCUS分別為88％、42％、64％，MSP檢測(cè)Hep3B、HepG2、Huh-7中P2的甲基化程度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于SMMC-7721、BEL-7405、FOCUS。
　　 三、5-AZA-CdR使肝癌細(xì)胞株HNF4αP1、HNF4αP2表達(dá)

14、明顯上調(diào)
　　 用去甲基化藥物5-AZA-CdR處理肝癌細(xì)胞株FOCUS72小時(shí)后檢測(cè)P1甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示：FOCUS在去甲基化的藥物作用72小時(shí)后P1啟動(dòng)子甲基化程度降低，而HNF4αP1、HNF4αP2表達(dá)明顯上調(diào)，且均呈劑量依賴(P<0.05)。
　　 四、TGF-β1下調(diào)部分肝癌細(xì)胞株中HNF4αP1的表達(dá)
　　 TGF-β1分別處理肝癌細(xì)胞株Hep3B、HepG2、Huh-7、SMMC-7721、B

15、EL-7405和FOCUS72h后檢測(cè)HNF4αP1表達(dá)，結(jié)果顯示：?jiǎn)?dòng)子區(qū)甲基化程度較低的Hep3B、HepG2、Huh-7在TGF-β1作用后HNF4αP1表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，而啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度較高的SMMC-7721、BEL-7405、FOCUS在TGF-β1作用前后HNF4αP1表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　 五、DNA甲基化阻止TGF-β1調(diào)節(jié)HNF4αP1的表達(dá)
　　 5-AZA-CdR和TGF-β1聯(lián)合

16、或分別作用肝癌細(xì)胞株FOCUS，結(jié)果顯示：?jiǎn)斡?-AZA-CdR作用FOCUS(B組)，與空白對(duì)照組(A組)相比HNF4αP1表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，而單用TGF-β1作用FOCUS(C組)，與空白對(duì)照組(A組)相比HNF4αP1表達(dá)沒有變化，先用5-AZA-CdR刺激FOCUS3d使其去甲基化后聯(lián)合用TGF-β1處理(D組)，結(jié)果與單用5-AZA-CdR處理(B組)相比HNF4αP1表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。