甲基供體通過影響一碳代謝和DNA甲基化調(diào)節(jié)海馬細胞的增殖.pdf

1、海馬是腦內(nèi)重要的組成成分，與記憶、應(yīng)激、能量代謝等有著密切的關(guān)系。海馬可塑性強且對發(fā)育早期的環(huán)境敏感。充足的甲基供體供應(yīng)對腦的發(fā)育很重要。眾所周知，甜菜堿因為含有三個活性甲基是高效的甲基供體。在大鼠模型上，有研究表明妊娠期補充甲基供體（膽堿）能夠促進子代海馬細胞的增殖，抑制海馬細胞的凋亡，但具體機制尚不清楚。本文的目的是探究母體補充甲基供體甜菜堿對子代海馬細胞的影響，以及產(chǎn)生影響的具體機制。本文首先以新生仔豬為研究對象揭示妊娠母豬日糧添

2、加甜菜堿對雄性新生仔豬海馬內(nèi)甜菜堿/蛋氨酸代謝以及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達的影響，探究甲基供體甜菜堿影響海馬細胞增殖的機制;其次研究了這種影響能否延續(xù)到仔豬斷奶時期;此外，用HT-22海馬細胞進一步研究了細胞內(nèi)的分子機制。
　　1.甜菜堿通過影響一碳代謝和DNA甲基化調(diào)節(jié)新生仔豬海馬細胞的增殖
　　選擇12頭二元雜交母豬（長白×約克夏），進行人工授精（混合好的杜洛克公豬的精子），受精后的母豬被隨機平均分成對照組和試驗組兩組。二元

3、雜交母豬配種前一個月飼喂標(biāo)準(zhǔn)日糧，配種后對照組飼喂標(biāo)準(zhǔn)日糧，試驗組飼喂添加甜菜堿(3 g/kg)的日糧，一天飼喂3次，并自由飲水，直至分娩結(jié)束。等到母豬分娩后，選擇平均體重的雄性仔豬（每組六頭）采集血液和海馬樣品。將海馬樣品裝入標(biāo)記好的2 mL的EP管內(nèi)，然后迅速投入液氮中，之后轉(zhuǎn)移至-75℃保存。血液完全凝固后，離心取血清，于-20℃保存。
　　實驗發(fā)現(xiàn)，妊娠母豬飼喂甜菜堿沒有改變新生仔豬體重、海馬重、海馬重/體重，但是增加了海

4、馬DNA含量以及增殖相關(guān)基因mRNA的表達。飼喂甜菜堿組顯著增加新生仔豬血液內(nèi)蛋氨酸的含量并顯著上調(diào)新生仔豬海馬內(nèi)BHMT、GNMT和DNMT1的mRNA和蛋白的表達。在甜菜堿組新生仔豬海馬內(nèi)胰島素樣生長因子2(IGF2)和它的受體IGF1R和IGF2R的表達都顯著增加，同時伴隨著下游信號通路ERK1/2的激活，此外IGF2的差異甲基化區(qū)域DMR1和DMR2高甲基化。以上結(jié)果說明:妊娠母豬日糧添加甜菜堿可以促進新生仔豬海馬內(nèi)甜菜堿/蛋氨

5、酸代謝以及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達，進而引起IGF2的DMR高甲基化并伴隨著IGF2和細胞增殖/抗凋亡的基因高表達。
　　2.甜菜堿通過影響一碳代謝和DNA甲基化調(diào)節(jié)斷奶仔豬海馬細胞的增殖
　　母豬分娩后對照組繼續(xù)飼喂標(biāo)準(zhǔn)日糧，試驗組繼續(xù)飼喂添加甜菜堿(3 g/kg)的日糧，每天飼喂兩次，時間分別為10:00和16:00，每次飼喂的量相等，自由飲水。仔豬在28日齡斷奶采樣。選擇平均體重的雄性仔豬（每組六頭）采集血液和海馬樣品。

6、將海馬樣品裝入標(biāo)記好的2 mL的EP管內(nèi)，然后迅速投入液氮中，之后轉(zhuǎn)移至-75℃保存。血液完全凝固后，離心取血清，于-20℃保存。實驗發(fā)現(xiàn):妊娠母豬飼喂甜菜堿顯著增加了斷奶仔豬血液內(nèi)甜菜堿的含量，并下調(diào)斷奶仔豬海馬內(nèi)BHMT的蛋白表達。但是，妊娠母豬飼喂甜菜堿沒有改變斷奶仔豬體重、海馬重、海馬重/體重和日增重，也沒有改變仔豬海馬的DNA含量以及增殖相關(guān)基因的mRNA表達以及基因組DNA甲基化水平。以上結(jié)果說明，妊娠母豬日糧添加甜菜堿對新

7、生仔豬海馬細胞增殖的影響沒有延續(xù)到斷奶仔豬。
　　3.甲基供體影響海馬細胞增殖的機制
　　1)高低劑量甜菜堿對海馬細胞BHMT蛋白表達的影響
　　甜菜堿對新生仔豬和斷奶仔豬的影響不同。推測這種差異可能是由于兩個時期內(nèi)血液中甜菜堿的含量不同引起代謝過程中關(guān)鍵酶BHMT的表達不同造成的。進而我們設(shè)計了一個小實驗來研究高低劑量甜菜堿對海馬細胞BHMT蛋白表達的影響。將HT-22小鼠海馬細胞培養(yǎng)在DMEM+10％ FBS的培養(yǎng)

8、基中。試驗共分3組:(1)空白組(Con);(2)低劑量甜菜堿組（1μM甜菜堿）(LB);(3)高劑量甜菜堿組（1mM甜菜堿）(HB);在細胞生長到70％時更換培養(yǎng)液，按照分組分別加入不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h;之后棄掉培養(yǎng)基收細胞。實驗發(fā)現(xiàn):高低劑量甜菜堿對細胞活力以及BHMT的蛋白表達均沒有影響。暗示著造成新生仔豬和斷奶仔豬結(jié)果不同的原因可能是甜菜堿沒有直接發(fā)揮作用，而是通過影響葉酸的代謝途徑發(fā)揮作用。
　　2)葉酸影響海馬細胞

9、增殖的機制
　　采用小鼠海馬神經(jīng)細胞系(HT-22)進行培養(yǎng)，試驗共分2組:(1)對照組(Con)(2)葉酸缺乏組(FD);在細胞生長到70％時更換培養(yǎng)液，按照分組分別加入不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h;之后吸掉培養(yǎng)基，收細胞。
　　實驗發(fā)現(xiàn):培養(yǎng)基中葉酸缺乏可以顯著降低細胞活力，降低海馬細胞DNA含量和增殖相關(guān)基因的表達以及培養(yǎng)基中IGF1的含量。卻顯著上調(diào)細胞內(nèi)BHMT、MAT2b和DNMT3a的蛋白表達。說明葉酸對海馬細胞的

10、增殖很重要，不僅可以影響蛋氨酸代謝通路，也可以影響增殖相關(guān)因子IGF1。
　　綜上所述:妊娠母豬日糧添加甜菜堿可以促進新生仔豬海馬內(nèi)甜菜堿/蛋氨酸代謝以及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達，進而引起IGF2的DMR高甲基化并伴隨著IGF2和細胞增殖/抗凋亡的基因高表達。但是這種影響并不能持續(xù)到斷奶時期。探究其中可能的機制，推測這種現(xiàn)象是由于血液內(nèi)甜菜堿含量高低不同造成的。為此，我們做了一個小實驗，結(jié)果顯示培養(yǎng)基中高低劑量甜菜堿對海馬細胞的BH