膽道閉鎖中T細(xì)胞ERK通路調(diào)控甲基化敏感基因IFN-γ高表達(dá)的研究.pdf

1、膽道閉鎖(Biliary Atresia，BA)是新生兒膽汁淤積的常見病因，亦是兒童最常見的嚴(yán)重肝臟疾病，以肝內(nèi)和肝外膽管的進行性炎癥和纖維性梗阻為特征，從而導(dǎo)致膽汁淤積以及進行性的肝纖維化和肝硬化，不手術(shù)治療很少能活過2歲。即使成功進行了Kasia手術(shù)并重建膽汁流出道，仍然有68％～80％膽道閉鎖患兒在手術(shù)后因為各級膽管進行性梗阻及炎癥損傷，導(dǎo)致膽汁淤積和肝纖維化加重，進展為肝功能衰竭，最終需要接受肝臟移植。肝內(nèi)膽道上皮細(xì)胞炎癥損傷、

2、凋亡和肝纖維化、肝硬化是膽道閉鎖的主要病理改變，其發(fā)生和發(fā)展機制尚不明確。一般認(rèn)為其發(fā)病機制涉及病毒感染、自身免疫介導(dǎo)的膽管破壞及膽道發(fā)育異常；是一種病毒介導(dǎo)的自身免疫性疾病，主要是CD4+Th1介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)過程。同卵雙胎兒并沒有同時發(fā)展為BA，說明非遺傳性因素在BA發(fā)病中起著重要作用。為進一步闡明該病的發(fā)病機制，本研究借助全基因組甲基化芯片及生物信息學(xué)技術(shù)對BA外周血單個核細(xì)胞中全基因甲基化狀態(tài)及相互關(guān)系進行研究；然后對甲基化敏

3、感免疫相關(guān)基因IFN-γ在膽道閉鎖中的表達(dá)情況進行研究，并探討ERK信號通路在膽道閉鎖中的表達(dá)情況以及與DNA甲基化異常的關(guān)系。
　　 第一部分膽道閉鎖患兒外周血單個核細(xì)胞全基因組甲基化狀態(tài)
　　 目的：利用全基因組甲基化芯片技術(shù)及生物信息學(xué)方法對膽道閉鎖患兒外周血單個核細(xì)胞的全基因組甲基化狀態(tài)進行研究，以進一步闡明該病的發(fā)病機制。方法：采集膽道閉鎖患兒和正常健康兒外周靜脈血，淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，提取DNA，經(jīng)

4、DNA甲基化修飾試劑盒處理后，采用人類全基因組甲基化芯片(450K Infiniam Methylation BeadChip)對全基因組中大于450000的CpG島或CoG位點進行差異甲基化分析。每個CpG位點設(shè)計兩個探針：甲基化和去甲基化探針。對所得差異基因甲基化位點進行校正方法及差異分析。
　　 結(jié)果：在膽道閉鎖患兒的DNA中共篩選出5611個差異甲基化位點，其中4300個發(fā)生低甲基化，1311個發(fā)生高甲基化，分別代表13

5、75和704個基因，差異均有顯著性意義(p<0.05)。根據(jù)基因的功能不同，再進一步增加限定條件后，篩選出免疫相關(guān)基因的差異甲基化位點133個，其中低甲基化位點87個，高甲基化位點46個，分別代表25和19個基因，差異均有顯著性意義(p<0.05)。而在膽道閉鎖免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用的甲基化敏感基因干擾素-γ(IFN-γ)亦具有明顯的低甲基化趨勢。
　　 結(jié)論：膽道閉鎖患兒外周血單個核細(xì)胞全基因中低甲基化的位點占據(jù)明顯優(yōu)勢，免疫

6、相關(guān)基因的低甲基化位點明顯增多，其中甲基化敏感免疫相關(guān)基因IFN-γ處于低甲基化狀態(tài)。本部分研究為膽道閉鎖發(fā)病機制的研究提供了新的切入點。
　　 第二部分膽道閉鎖患兒外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的整體甲基化狀態(tài)及甲基化敏感基因IFN-γ的表達(dá)研究
　　 目的：研究膽道閉鎖患兒外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的整體甲基化狀態(tài)和干擾素-γ(IFN-γ)基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)，并觀察IFN-γ基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況。
　　 方法

7、：選取15例膽道閉鎖及12例健康對照組進行對比研究；提取外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的DNA和RNA；采用通用甲基化定量試劑盒檢測整體甲基化胞嘧啶表達(dá)水平；實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time RT-PCR)檢測DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)、甲基化CpG結(jié)合蛋白(MBDs)和IFN-γ的mRNA表達(dá)水平。亞硫酸氫鈉-測序法檢測IFN-γ啟動子區(qū)DNA甲基化水平。
　　 結(jié)果：膽道閉鎖組CD4+T淋巴細(xì)胞中的整體平均甲基

8、化水平明顯低于對照組(p<0.0001)。與對照組相比，膽道閉鎖組CD4+T細(xì)胞中DNMT1和DNMT3a在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)明顯降低(p值分別為0.0012和0.0210)。膽道閉鎖組CD4+T細(xì)胞中MBD1轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)明顯低于對照組(p=0.0029)，而MBD4轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)明顯升高(p=0.0199)；DNMT3b、MBD2和MeCP2在膽道閉鎖組與對照組之間無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。膽道閉鎖組CD4+T細(xì)胞中DNMTI轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)與整體DNA

9、甲基化水平呈正性相關(guān)(γ=0.6290，p=0.0120)。與對照組相比，IFN-γ在膽道閉鎖組CD4+T細(xì)胞中表達(dá)明顯升高(p=0.0376)，其啟動子區(qū)域處于低甲基化狀態(tài)，并與整體DNA甲基化水平呈負(fù)性相關(guān)(γ=-0.5720，p=0.026)。
　　 結(jié)論：膽道閉鎖患兒外周血CD4+T細(xì)胞中整體平均甲基化水平低下；在膽道閉鎖CD4+T細(xì)胞中，IFN-γ基因啟動子區(qū)域亦處于低甲基化狀態(tài)，與整體DNA甲基化水平呈負(fù)性相關(guān)，該現(xiàn)

10、象可能與膽道閉鎖發(fā)病有一定關(guān)系。
　　 第三部分膽道閉鎖患兒外周血CD4+T淋巴細(xì)胞ERK信號通路的狀態(tài)及與DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1的關(guān)系
　　 目的：研究膽道閉鎖患兒外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號通路的狀態(tài)，探討其與DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)的關(guān)系；并在體外Jurkat細(xì)胞中進行驗證。
　　 方法：選取20例膽道閉鎖患兒及15例健康對照組進行對比研究；提取外周血CD4+T淋巴細(xì)胞

11、蛋白質(zhì)，采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Western-blot)檢測ERK信號通路關(guān)鍵分子ERK1/2及其磷酸化水平(p-ERK1/2)，并檢測DNMTI的表達(dá)情況；用20 mM的PD98059處理Jurkat細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，Western-blot檢測處理前后ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白水平以及DNMT1的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：與對照組相比較，膽道閉鎖中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平均明顯下降，DNMT1的蛋白表