肝素金納米粒子的制備及其對(duì)抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)的識(shí)別.pdf

1、近年來(lái)，金納米粒子由于其特殊的化學(xué)和物理性質(zhì)，在催化、光學(xué)、電學(xué)、表面增強(qiáng)拉曼散射、生物傳感器及納米技術(shù)等新興領(lǐng)域表現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用前景。大分子如蛋白質(zhì)、DNA等修飾的金納米粒子由于其光學(xué)特性越來(lái)越受到關(guān)注，并被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、診斷學(xué)等領(lǐng)域。糖類化合物也是一種生物大分子，可以與其他物質(zhì)形成糖脂和糖蛋白等，因此具有細(xì)胞識(shí)別、免疫活性等多種生理活性功能。但是糖類修飾的金納米粒子的研究尚在發(fā)展階段，其制備及檢測(cè)條件還不成熟，需要進(jìn)行深入探討

2、。 肝素是存在于哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞表面帶負(fù)電的高度硫酸化多糖，能與多種蛋白質(zhì)作用，因此有重要的生物學(xué)活性。本文主要研究肝素金納米粒子的制備條件及其對(duì)抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）的檢測(cè)。包括：（1）巰基化肝素衍生物的制備；（2）巰基化肝素衍生物修飾的金納米粒子的制備；（3）肝素金納米粒子對(duì)抗凝血酶Ⅲ的檢測(cè)。 通過(guò)亞硝酸降解的方法，將肝素鈉制備成末端帶有醛基的低分子量肝素。對(duì)巰基苯胺和末端帶醛基的肝素會(huì)形成不穩(wěn)定的希夫堿結(jié)構(gòu)（Schi

3、ff Base），在氰基硼氫化鈉催化下，通過(guò)還原胺化的方法，制備出末端有巰基的肝素衍生物?？刂品磻?yīng)時(shí)間等反應(yīng)條件，考察其對(duì)巰基化肝素含量的影響。用Ellman試劑對(duì)巰基肝素衍生物的取代度進(jìn)行測(cè)定，確定產(chǎn)物中巰基的含量。發(fā)現(xiàn)在溶劑為二甲亞砜與冰醋酸的體積比為8:1時(shí)，反應(yīng)6h，11.13％的肝素被衍生化。用紅外光譜儀（ FTIR）和核磁共振光譜儀對(duì)末端帶有醛基的肝素和巰基化肝素衍生物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，驗(yàn)證了肝素衍生物中巰基的存在。

4、通過(guò)檸檬酸鈉還原法制備得到金納米粒子，探討還原劑加入量以及pH值對(duì)制備納米粒子的影響。發(fā)現(xiàn)制備金納米粒子時(shí)，當(dāng)檸檬酸鈉與氯金酸的摩爾比為6:1時(shí)，制備出粒徑均一且分散性好的金納米粒子，且在pH值中性至堿性范圍內(nèi)能保持穩(wěn)定。透射電鏡的結(jié)果表明制備得到的金納米粒子粒徑均一，平均粒徑在10 nm。紫外分光光度計(jì)測(cè)定其紫外最大吸收波長(zhǎng)在523 nm處?？疾焱度氩煌瑤€基化肝素衍生物的量對(duì)修飾后金納米粒子的影響，確定合適的肝素衍生物修飾量為0.12

5、5～25 mg/ml，且在0.5 h內(nèi)，結(jié)合率達(dá)到最高，結(jié)合率在27％～38％。修飾后金納米粒子的粒徑發(fā)生改變，平均粒徑為22 nm，其紫外最大吸收波長(zhǎng)在531 nm處，比修飾前紅移8 nm，說(shuō)明金納米粒子的粒徑大小對(duì)紫外吸收有影響。并且肝素以Au—S共價(jià)鍵合的方式定向固定在金納米粒子表面，穩(wěn)定性好，不受外界條件影響。 最后探討了巰基化肝素修飾的金納米粒子用于檢測(cè)抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）的檢測(cè)靈敏度及最小檢測(cè)限。在紫外分光光度計(jì)的檢

6、測(cè)下，當(dāng)溶液中的ATⅢ的含量最低為17.2 pmol時(shí)，紫外最大吸收波長(zhǎng)為534 nm，比不含有ATⅢ的溶液紫外最大吸收533 nm，紅移1 nm。隨著加入AT—Ⅲ量的增多，波長(zhǎng)紅移更為明顯。同時(shí)用金納米粒子標(biāo)記的抗體A4C11和A14A11來(lái)檢測(cè)甲胎蛋白。當(dāng)兩種抗體標(biāo)記時(shí)間為6小時(shí)，結(jié)合率達(dá)到最高，分別為70.39％和92.29％。當(dāng)甲胎蛋白的濃度最低為1.21 ng/ml時(shí)，金納米粒子的紫外最大吸收波長(zhǎng)為533 nm，而不含有甲胎蛋