肝素—瓊脂糖凝膠的制備及其在分離純化抗凝血酶Ⅲ中的應(yīng)用.pdf

1、從血漿中分離純化各種藥用蛋白質(zhì)仍然是生物技術(shù)的重要產(chǎn)業(yè)，而高純度微量血漿蛋白制品的開發(fā)是血液制品發(fā)展的一個(gè)不容忽視的趨勢(shì)；其中抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)是體內(nèi)最重要的抗凝血物質(zhì)，占血漿中總抗凝血酶活性的50-60％。AT-Ⅲ是一種含糖10％的單鏈α2糖蛋白，相對(duì)分子量為58～64KD，由432個(gè)氨基酸組成，是人血漿中主要的生理性凝血酶抑制蛋白。AT-Ⅲ制劑自1974年試用于臨床以來(lái)，其療效肯定，適應(yīng)癥日益增多，特別是預(yù)防和治療肝腎疾病、彌漫

2、性血管內(nèi)凝血(DIC)等癥。分離純化AT-Ⅲ的技術(shù)受到人們的普遍重視和關(guān)注。層析法以其特有的選擇性和靈活性在血漿蛋白的分離純化中起著舉足輕重的作用，它已成為獲得某些較高純度微量血漿蛋白不可或缺的方法。 　　綜觀AT-Ⅲ的分離純化歷史，除了最初采用氫氧化鋁、磷酸鈣吸附、離子交換層析等制備方法外，自1970年以來(lái)，AT-Ⅲ的制備方法中都至少用了一次肝素親和層析，縮短了流程，提高了收率和純度。因而在AT-Ⅲ的分離純化過(guò)程中，肝素親和層析是關(guān)

3、鍵步驟。目前在國(guó)內(nèi)此類親和介質(zhì)主要依靠進(jìn)口，價(jià)格昂貴(約300元/g)，制備方法保密，使得們-Ⅲ分離純化的成本很高，難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。因此，研究制備肝素親和層析介質(zhì)具有重要意義。肝素親和層析介質(zhì)的制備方法一般包括載體的活化和偶聯(lián)兩個(gè)步驟。姜世明等人利用Pharmacia公司的Sepharose4B為基質(zhì)，采用環(huán)氧氯丙烷活化，然后將其直接和肝素偶聯(lián)，制得肝素-瓊脂糖凝膠；這種方法利用環(huán)氧基與肝素上的氨基反應(yīng)，由于肝素分子上有多個(gè)氨基，會(huì)發(fā)生

4、多點(diǎn)結(jié)合，使得肝素分子的天然構(gòu)型發(fā)生變化，從而在一定程度上會(huì)影響分離純化效果。本文采用另一種偶聯(lián)方式，即環(huán)氧氯丙烷活化的瓊脂糖凝膠經(jīng)過(guò)胺化過(guò)程后，利用還原胺化反應(yīng)，胺化后的介質(zhì)和肝素的末端醛基反應(yīng)，能確保其它基團(tuán)的完整性，而不影響肝素的親和活性。另外，本研究采用自制的瓊脂糖凝膠6FF介質(zhì)，這種基質(zhì)交聯(lián)度比較高，具有很好的機(jī)械強(qiáng)度，可在高流速的條件下使用。將肝素(Heparin)作為配基偶聯(lián)到實(shí)驗(yàn)室自制的瓊脂糖凝膠6FF上，在得到肝素-瓊