戊型肝炎病毒基因4型在PLC-PRF-5細(xì)胞中的培養(yǎng)及其特征研究.pdf

1、戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)是戊型肝炎(Hepatitis E，HE)的病原體。HEV分為4個(gè)基因型，其中4型是我國(guó)流行的主要基因型。我國(guó)為HEV的流行區(qū)，HE占我國(guó)急性病毒性肝炎20％左右，病死率為1.4％-5.3％，而孕婦中的病死率可達(dá)25％，這使得HE成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前限制我國(guó)HEV研究的主要原因?yàn)槿狈σ粋€(gè)高效穩(wěn)定的HEV體外培養(yǎng)系統(tǒng)，雖然國(guó)外Tanaka和Shukla等分別于2007年

2、和2011年建立了HEV的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，但我們無(wú)法獲得其毒種。本研究中，我們利用感染HEV4型的恒河猴的糞便制備毒種，在PLC/PRF/5細(xì)胞中建立了HEV4型的體外培養(yǎng)系統(tǒng)。通過(guò)積累經(jīng)驗(yàn)和條件優(yōu)化，提高細(xì)胞培養(yǎng)的效率和穩(wěn)定性，并在此基礎(chǔ)上，對(duì)HEV在細(xì)胞培養(yǎng)中的部分特性進(jìn)行研究。
　　取HEV4型感染恒河猴4周后的糞便制備毒種，接種15株候選細(xì)胞株，結(jié)果顯示HEV4型僅可在PLC/PRF/5細(xì)胞中復(fù)制并釋放至培養(yǎng)上清中。對(duì)HEV

3、的接種時(shí)間和接種溫度進(jìn)行優(yōu)化，接種時(shí)間為2、4、6和24小時(shí)條件下，1.0×106拷貝/mlHEV接種PLC/PRF/5細(xì)胞的出毒率（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差，RSD）分別為:35％(RSD=39％)、60％(RSD=23％)、95％(RSD=12％)和100％(RSD=0％)，接種時(shí)間2、4、6小時(shí)陽(yáng)性率間具有顯著性差異(p＜0.05)。接種溫度分別為37℃和40℃時(shí)，1.0×106拷貝/ml HEV接種PLC/PRF/5細(xì)胞的出毒率(RSD)分別

4、為:35％(RSD=39％)和55％(RSD=20％)，結(jié)果間無(wú)顯著性差異(p≥0.05)，最終確定接種時(shí)間為6小時(shí)，接種溫度為40℃或37℃。
　　使用DMEM/M199等比混合培養(yǎng)基替代MEM培養(yǎng)基做為PLC/PRF/5細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基和維持培養(yǎng)基后，培養(yǎng)上清中HEV RNA的檢出時(shí)間由接種后2周提前至接種后1周，pORF2檢出時(shí)間由接種后4周提前至2-3周。分析DEMM/M199培養(yǎng)基同MEM培養(yǎng)基成份差異，確定12種物質(zhì)可能

5、影響HEV的出毒時(shí)間。分別測(cè)試這12種物質(zhì)對(duì)于HEV出毒時(shí)間的影響，最終確定膽固醇的影響最大。以添加2μg/ml膽固醇的MEM培養(yǎng)基作為生長(zhǎng)培養(yǎng)基和維持培養(yǎng)基，培養(yǎng)上清中HEV pORF2和RNA的變化趨勢(shì)與以DMEM/M199為生長(zhǎng)培養(yǎng)基和維持培養(yǎng)基時(shí)的變化趨勢(shì)相同，說(shuō)明培養(yǎng)基中添加膽固醇可顯著提高HEV在PLC/PRF/5細(xì)胞中的感染和復(fù)制能力，該能力具有代次限制，PLC/PRF/5細(xì)胞需在含膽固醇培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少3代，且該能力不能

6、通過(guò)細(xì)胞凍存保留。
　　攻毒細(xì)胞中未觀察到明顯的細(xì)胞病變。免疫熒光染色出毒后細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)存在陽(yáng)性熒光，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)和比較接種細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞的圓度、面積，兩者間無(wú)顯著性差異（p≥0.05），接種細(xì)胞感染率約為10.1％。透射電鏡觀察培養(yǎng)上清和出毒后細(xì)胞，可見(jiàn)有包膜的病毒顆粒，通過(guò)交叉ELISA試驗(yàn)確定培養(yǎng)上清中的HEV病毒顆粒存在包膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果尚需免疫電鏡確認(rèn)。中和試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1株抗pORF2單抗（34＃單抗）可中和培養(yǎng)上清中H

7、EV病毒感染靶細(xì)胞，1份高滴度人血清樣品(9EM)和兩株單抗（15＃和72＃單抗）具有部分中和活性。使用分段表達(dá)的HEV1型和4型pORF2片段定位3株單抗的識(shí)別表位，除72＃單抗識(shí)別表位為構(gòu)象型表位外，34＃和15＃單抗識(shí)別的表位均位于HEV1型pORF2的390aa-607aa和HEV4型pORF2的404aa-621aa。HEV體外傳代5個(gè)代次，各代次病毒接種后上清中HEVRNA濃度和pORF2 S/Co均值上升速度的差異不明顯。

8、
　　基因芯片檢測(cè)HEV感染引起的PLC/PRF/5細(xì)胞的基因表達(dá)譜的變化，4個(gè)IFN誘導(dǎo)基因表達(dá)水平發(fā)生變化，包括:IFI27（7.07倍）、CMPK2（4.03倍）、IFI6（3.82倍）和MX1（2.75倍）。繼而又檢測(cè)500IU/ml IFN-α2b處理對(duì)HEV復(fù)制的影響。與對(duì)照組比較，HEV的復(fù)制在IFN-α2b處理后1-7天被部分抑制，之后，處理組HEV的復(fù)制逐漸恢復(fù)，達(dá)到與對(duì)照組相當(dāng)?shù)乃健?br>　　本研究中，我們