食蟹猴與大鼠脊髓損傷的比較及水凝膠—神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)大鼠脊髓的保護(hù).pdf

1、脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)是臨床最嚴(yán)重的外傷之一，往往導(dǎo)致不同程度的殘障，并且自我修復(fù)能力有限，給病患、家庭和社會(huì)造成巨大的影響和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。鑒于缺乏有效的治療的手段，世界各國(guó)政府和很多組織投入大量的人力物力進(jìn)行脊髓損傷后修復(fù)的研究。雖然有很多研究報(bào)道各種治療策略有助于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如大鼠、小鼠等脊髓損傷的恢復(fù)，但是到目前為止仍然缺乏有效的臨床干預(yù)措施，其中一個(gè)原因是人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)包括脊髓在內(nèi)的解剖結(jié)構(gòu)以及損傷后的

2、病理過(guò)程不同于常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)研究成果轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用很困難。為了能在實(shí)驗(yàn)室研究和臨床應(yīng)用之間建立一個(gè)良好的過(guò)渡，使新的研究發(fā)現(xiàn)可以及早轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)，服務(wù)于患者，使用接近于人類的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是一個(gè)重要的考量。
　　非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(non-humanprimate)的解剖學(xué)和生理學(xué)特征，特別是一些重要傳導(dǎo)束的走行和功能與人類接近。將猴作為脊髓損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，有助于對(duì)臨床前期研究進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑u(píng)估，并促進(jìn)其向臨床轉(zhuǎn)化。迄今為止對(duì)猴脊髓

3、損傷后病理變化的研究不是很多。本研究旨在通過(guò)引入食蟹猴脊髓中胸段半橫斷模型，拓寬對(duì)損傷部位病理變化的了解，以便為針對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和機(jī)制的研究提供一些新的思路。
　　本研究第一部分主要目的是研究食蟹猴脊髓胸右側(cè)半橫斷損傷后7天和30天，在損傷部位的三個(gè)區(qū)域，即損傷中心、圍損傷區(qū)和左側(cè)未損傷區(qū)內(nèi)軸突、髓鞘、小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和膠原纖維在損傷后的變化，并與對(duì)照組進(jìn)行了對(duì)比。在研究中我們通過(guò)各類神經(jīng)細(xì)胞及軸突標(biāo)記物的免

4、疫組織化學(xué)染色，同時(shí)結(jié)合髓鞘和膠原纖維的化學(xué)染色法，觀察損傷后急性期、亞急性期各項(xiàng)指標(biāo)的變化。通過(guò)綜合分析數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了食蟹猴脊髓損傷的一些特點(diǎn)，可能對(duì)以后治療策略的研究有指導(dǎo)意義。這部分研究表明，損傷區(qū)軸突和髓鞘在損傷后7天和30天顯著減少，但是在左側(cè)未損傷區(qū)同樣觀察到有軸突和髓鞘的退行化改變。Iba1陽(yáng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞損傷后7到30天在損傷中心區(qū)呈逐漸減少的趨勢(shì)，只有圍損傷區(qū)在急性期有所增加，隨后也開(kāi)始減少。而KP1陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞數(shù)量在

5、7天及30天的損傷區(qū)及其周圍聚集，反應(yīng)性增強(qiáng)。雖在亞急性期開(kāi)始回落，但仍明顯高于對(duì)照組;左側(cè)未損傷區(qū)也有相似變化，提示有被二次損傷波及。GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量在損傷中心區(qū)和左側(cè)未損傷區(qū)呈相反的發(fā)展趨勢(shì)，前者是損傷后7天到30天逐漸減少，后者是逐漸增加;細(xì)胞形態(tài)也有明顯改變，損傷后胞體變肥大，突起增加，并形成密集的交聯(lián)，特別是在圍損傷區(qū)和未損傷區(qū)有星形細(xì)胞反應(yīng)性增生，但是沒(méi)有觀察到明顯疤痕組織。通過(guò)膠原化學(xué)染色的方法，我們發(fā)現(xiàn)在

6、損傷后7天，膠原纖維開(kāi)始沉積，30天形成圍繞損傷區(qū)域的疤痕組織。說(shuō)明在猴脊髓損傷模型中，膠原是疤痕組織的主要成分來(lái)源。
　　第二部分主要研究大鼠脊髓半橫斷損傷中心的細(xì)胞反應(yīng)，與第一部分相同，包括軸突和髓鞘的變化、膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)、小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的活化。通過(guò)與食蟹猴脊髓損傷比較，以期發(fā)現(xiàn)兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物損傷模型間的明顯差異，可以為接下來(lái)有針對(duì)性的治療方案提供準(zhǔn)備。實(shí)驗(yàn)表明:大鼠損傷后7天到30天，軸突和髓鞘顯著減少;圍損傷區(qū)軸突受到

7、波及，30天后即亞急性期有明顯變化;但是未損傷側(cè)的軸突數(shù)量和損傷中心兩側(cè)遠(yuǎn)端的髓鞘則沒(méi)有明顯的改變。小膠質(zhì)細(xì)胞在損傷后激活并在損傷部位聚集;細(xì)胞變圓，突起減少。圍損傷區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞也呈逐漸增加的趨勢(shì)。而ED-1陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞及激活的小膠質(zhì)細(xì)胞在對(duì)照組幾乎看不到，在損傷后所有區(qū)域都急劇增加。星形膠質(zhì)細(xì)胞在損傷部位和周圍反應(yīng)性增生，細(xì)胞形態(tài)也有明顯改變，突起增加，并形成密集的交聯(lián);遠(yuǎn)側(cè)未損傷區(qū)沒(méi)有明顯改變。膠原化學(xué)染色結(jié)果顯示，大鼠損傷后膠

8、原沒(méi)有明顯的變化，只有7天時(shí)有一過(guò)性的增加，可能是損傷導(dǎo)致的血管破裂或者新生血管長(zhǎng)入。
　　第三部分研究針對(duì)脊髓損傷軸突和髓鞘退變及疤痕組織增生的特點(diǎn)，探討將水凝膠(hydrogel)聯(lián)合神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子GDNF和或BDNF注射到大鼠脊髓損傷中心，通過(guò)行為學(xué)測(cè)試和組織學(xué)檢測(cè)，分析不同治療組合對(duì)大鼠脊髓功能恢復(fù)的影響。為更接近臨床應(yīng)用，我們使用了大鼠脊髓砸傷模型。我們發(fā)現(xiàn)損傷后第7天進(jìn)行移植注射，可以有效減小損傷;在各項(xiàng)行為學(xué)測(cè)試中，水

9、凝膠聯(lián)合GDNF-BDNF治療組在亞急性期均顯著優(yōu)于其他各組，促進(jìn)了大鼠脊髓功能的恢復(fù);水凝膠聯(lián)合GDNF和或BDNF有助于減小損傷范圍，延緩軸突的退行化，減少小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生和膠質(zhì)疤痕的形成，促進(jìn)血管生成和加強(qiáng)血供。這些研究結(jié)果為以后可能進(jìn)行的組織工程材料和細(xì)胞聯(lián)合移植在SCI中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也有助于成果更好地向臨床轉(zhuǎn)化。
　　總的來(lái)說(shuō)，這些研究結(jié)果表明，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物作為與人類最為

10、接近的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，脊髓損傷后有不同于嚙齒類動(dòng)物的自身特點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)食蟹猴脊髓損傷后星形細(xì)胞反應(yīng)較大鼠弱，而疤痕組織主要由浸潤(rùn)的膠原纖維構(gòu)成。大鼠損傷較為局限，而食蟹猴脊髓的耐受性比較差，未損傷一側(cè)脊髓也會(huì)被初次損傷或二次損傷波及，其原因可能是損傷后引起的缺血缺氧。提示我們?cè)趽p傷后對(duì)看似正常的組織也應(yīng)給予保護(hù)性治療。水凝膠作為一種人工合成的生物材料，免疫原性低，組織相容性好，能與宿主組織很好的融合在一起，不會(huì)形成明顯的界面，而且能誘導(dǎo)血管