氧干預長爪沙鼠全腦缺血再灌注氧化應激與能量代謝的研究.pdf

1、半個世紀以來，心肺復蘇后的低生存率狀況并沒有得到根本性的改觀，使得人們開始把目光從心肺復蘇術技術本身轉(zhuǎn)向如何更為科學有效的進行復蘇后治療[1]?；謴腿毖M織的血供可以阻止細胞損害的加重，但非常遺憾的是，它又不可避免地引發(fā)了一系列復雜而嚴重的缺血再灌注損害(ischemia-reperfusion injury，IRI)，并成為復蘇后綜合征的直接原因。腦在整個心肺復蘇的病理生理過程中，無論是缺血階段還是再灌注階段都最為敏感和易損。因而腦復

2、蘇成敗就成為了救治復蘇后死亡和功能障礙的關鍵。近年來，醫(yī)學工作者開始關注最為常規(guī)的復蘇治療方式-氧療，探索不同氧治療策略對心肺復蘇腦功能保護的影響。
　　心肺復蘇后重新恢復氧輸送對通過氧化磷酸化途徑而恢復能量物質(zhì)(adenosine triphosphate，ATP)的合成至關重要。然而，大量研究表明過量過快的恢復供氧卻加重了再灌注后的組織細胞損傷，究其原因可能為再灌注的早期階段的氧自由基爆發(fā)性生成。理論上，再灌注早期階段高氧分壓

3、環(huán)境可能會增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，從而加重氧化應激損傷，與氧相關的再灌注氧化應激損傷也就不可避免的發(fā)生了。氧化應激源于促氧化作用與抗氧化機制的失平衡和由此過多產(chǎn)生的ROS。腦對于ROS具有極高的敏感性，原因在于其特殊的生化和生理特性:它含有大量不飽和脂肪酸，可直接與自由基發(fā)生作用;腦內(nèi)自由基防御系統(tǒng)不完善，參與清除自由基的酶類或其它物質(zhì)如超氧化物歧化酶(superoxide dismu

4、tase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和維生素E等含量較少等，當某些因素誘發(fā)氧自由基大量產(chǎn)生時，遠遠超過細胞自身的抗氧化能力，就可以導致細胞內(nèi)大分子損傷，進而引起細胞受損、死亡或凋亡。既然氧自由基在心肺復蘇過程中存在的負面作用，以及理論上在復蘇再灌注階段提高氧輸送可能增加氧自由基的產(chǎn)生，那么人們開始對氧在心肺復蘇過程中的地位加以反思，對以往心肺復蘇后氧治療的隨意性提出質(zhì)疑。

5、　　目前國際上針對心肺復蘇尚沒有清晰明確的氧治療策略，為數(shù)不多的研究成果并沒有給出足夠的證據(jù)以明確心肺復蘇預后情況與吸入何種濃度氧之間有必然的聯(lián)系，更缺少大樣本的臨床研究加以支持。然而高的吸入氧濃度并不一定意味著高的氧輸送，在組織缺血再灌注這一病理生理過程中，低灌注甚至無灌注一直沒有有效的治療手段加以克服，當處于低灌注狀況下，提高氧輸送的唯一辦法就只能是提高循環(huán)體液的氧分壓水平，即提高吸入氧濃度來改善氧合狀況。在這種情況下，如何來平衡提

6、高供氧和減少再灌注氧化損害之間的矛盾關系，將成為今后腦復蘇領域亟待解決的重要課題。
　　本課題采用阻斷雄性長爪沙鼠雙側(cè)頸總動脈(bilateral carotid artery occlusion，BCAO)再開放法，建立急性全腦缺血再灌注動物模型，模擬腦復蘇過程中海馬CA1區(qū)羥自由基水平的動態(tài)變化過程，探討不同濃度、不同時相的氧療干預對羥自由基生成以及氧化應激的影響，并進一步研究缺血再灌注損傷對中樞神經(jīng)細胞能量代謝影響及機制，探

7、索更科學合理、切實可行的腦復蘇氧治療策略。
　　實驗材料及方法:
　　一、實驗動物
　　選取健康雄性長爪沙鼠，體重70-95g，由首都醫(yī)科大學實驗動物中心提供，清潔度為普通級，常規(guī)飼料，自由飲水，溫度22±1℃，濕度50％左右，明/暗周期為12h，動物實驗經(jīng)盛京醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，倫理學編號:2013PS139K
　　二、建立腦立體定位微透析及全腦缺血再灌注動物模型
　　長爪沙鼠適應實驗室環(huán)境5-7天后

8、，10％水合氯醛(按體重0.30ml/100g)腹腔注射麻醉，固定于腦立體定位儀，行頭部皮膚矢狀切口，暴露右側(cè)半球顱骨，參考立體定位解剖圖譜及預實驗結(jié)果定位右側(cè)海馬CA1區(qū)坐標(前囟后2mm，旁開2mm，硬腦膜下2.5mm)，鉆取直徑2mm骨窗，垂直插入自制微透析導軌，骨水泥并覆蓋顱骨創(chuàng)面。所有沙鼠術后均單獨飼養(yǎng)并恢復1天。
　　微透析導軌植入術后24小時，觀察實驗動物無任何行為、功能異常。常規(guī)麻醉鼠板固定，頸前正中切口，于雙側(cè)胸

9、鎖乳突肌及氣管旁間隙暴露頸動脈鞘，仔細分離雙側(cè)頸總動脈及迷走神經(jīng)，無創(chuàng)顯微動脈夾阻斷并計時（10分鐘）后開放阻斷，以動脈顏色變紅及血流搏動證實再灌注成功，建立全腦缺血再灌注模型。
　　阻斷雙側(cè)頸總動脈前30分鐘，給予沙鼠經(jīng)口氣管插管及機械通氣，設定定容通氣模式，VT2.5ml，f70次/分，I∶E=1∶1，F(xiàn)1O2:30％,再灌注建立后按簡單隨機法分組并調(diào)整F1O2:常壓常氧治療組(NO，F(xiàn)1O2:30％2小時)、常壓高氧治療組(

10、HO，F(xiàn)1O2:100％2小時)及延遲常壓高氧治療組(DHO，F(xiàn)1O2:30％1h then100％1h total2 h)以及正常對照組(Sham-Control)，共4組。
　　股動脈插管，監(jiān)測血壓（平穩(wěn)無顯著波動）及血氣采樣。
　　調(diào)整呼吸機參數(shù)維持血氣指標:PaO260-70mmHg（常壓常氧）或PaO2＞300mmHg（常壓高氧），PaCO235-50 mmHg，PH7.35-7.45。
　　直腸溫度監(jiān)測:烤

11、燈維持體溫37±0.5℃
　　三、主要實驗方法
　　1、采用活體腦立體定位微透析對海馬CA1區(qū)連續(xù)采樣，高效液相色譜-電化學法(high performance liquid chromatography-electrochemical detect,HPLC-ECD)定量檢測微透析液中二羥基苯甲酸(dihydroxybenzoic acid，DHBA)。
　　2、采用Western blot雜交技術檢測海馬組織低氧誘

12、導因子(hypoxia-induciblefactor-1，HIF-1α)、丙酮酸脫氫酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase1，PDK1)表達
　　3、采用RT-PCR技術檢測海馬組織中HIF-1αmRNA、PDK1mRNA的表達。
　　4、采用免疫組化技術檢測腦內(nèi)HIF-1α、PDK1的表達與定位。
　　5、采用ELISA試劑盒檢測超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛（

13、malondialdehyde，MDA）、丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)活性及磷酸化丙酮酸脫氫酶(phosphorylated PDH E1α subunit ser232，PDHA1-S232)含量。
　　6、采用尼氏染色及透射電鏡技術對進行神經(jīng)元形態(tài)學及亞細胞器檢測。
　　結(jié)果:
　　1、全腦缺血再灌注及腦立體定位微透析長爪沙鼠模型建立:全腦缺血時間，即BCAO時間選定為10分

14、鐘，滿足對組織內(nèi)羥自由基捕獲及檢測的穩(wěn)定性，同時降低造模及術后觀察期間實驗動物的死亡率;微透析探針準確定位于沙鼠右側(cè)半球海馬CA1區(qū);在設定色譜條件下DHBA在0.125-100 ng/ml之間存在良好峰高線性關系，檢測方法敏感性高、重復性好，室溫條件下5次進樣10 ng/ml2.3-DHBA及2.5-DHBA標準品溶液，測得的相對標準偏差(RSD)分別為6.5％和6.1％，而10次進樣50 ng/ml2.3-DFIBA及2.5-DHB

15、A標準品溶液，測得的RSD分別為2.9％和3.3％，微透析探針在穩(wěn)定1小時條件下，對2.3-DHBA及2.5-DHBA標準品液的回收率(n=5)分別為（69.1±4.6）％和（74.3±3.2）％，最終可以達到對連續(xù)微透析液采樣監(jiān)測目標物濃度變化的技術要求。
　　2、全腦缺血再灌注這一病理生理過程中，海馬CA1區(qū)存在再灌注早期ROS，特別是·HO(2.3-DHBA、2.5-DHBA)的爆發(fā)性生成，DHBA的濃度具有動態(tài)演變及時效性

16、特點，供氧濃度變化對DHBA有直接影響:①全腦缺血階段，微透析液中2.3-DHBA及2.5-DHBA濃度保持穩(wěn)定，較對照組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。②再灌注早期階段，NO及HO組微透析液中2.3-DHBA及2.5-DHBA濃度均呈現(xiàn)爆發(fā)性升高，達峰值后逐漸降低回正常水平，整個動態(tài)演變過程于再灌注2小時內(nèi)完成，其中NO組中2.3-DHBA濃度較對照組明顯升高(P＜0.05)的時間節(jié)點為:10-40min共4點，2.5-DHBA濃度較對

17、照組明顯升高(P＜0.05)的時間節(jié)點為:10-50min共5點;HO組中2.3-DHBA濃度較對照組明顯升高(P＜0.05)的時間節(jié)點為:10-60min共6點，2.5-DHBA濃度較對照組明顯升高(p＜0.05)的時間節(jié)點為:10-80min共8點。此外，HO組2.3-DHBA濃度較NO組明顯升高(P＜0.05)時間節(jié)點位于10-60min共6點，而2.5-DHBA濃度較NO組明顯升高(P＜0.05)時間節(jié)點位于20-80min共7

18、點。⑧以NO組DHBAs動態(tài)變化規(guī)律為基礎設計的DHO組（F1O2:30％1小時再100％1小時，總計2小時），在10-120min的各個時間節(jié)點監(jiān)測微透析液中2.3-DHBA及2.5-DHBA濃度變化較NO組均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　3、全腦缺血再灌注的早期階段（再灌注2小時），其海馬、皮質(zhì)組織中抗氧化酶SOD、CAT活性明顯降低，而脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA則顯著升高，同時氧暴露濃度變化對MDA有直接影響:①NO、HO及

19、DHO組SOD、CAT活性相比對照組均有明顯降低(P＜0.05)，但各組間比較無明顯差異(P＞0.05);同時NO、HO及DHO組MDA較對照組顯著升高(P＜0.05);同時NO、DHO組間比較MDA濃度無差異(P＜0.05)，但二者和HO組比較，HO組中海馬、皮質(zhì)組織MDA濃度較NO、DHO兩組均有顯著增加(P＜0.05)。
　　4、PDH活性檢測:再灌注2小時NO、HO、DHO組海馬、皮質(zhì)組織內(nèi)PDH活性較對照組均有降低，其中

20、NO及HO兩組與對照組間有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而DHO組與對照組比較減低不明顯（P＞0.05），DHO組PDH活性較NO、HO組增加有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　5、PDHA1-S232磷酸化檢測:再灌注2小時各組海馬、皮質(zhì)組織內(nèi)磷酸化PDHAl-S232程度較對照組均有增高，其中NO組較HO、DHO組的磷酸化水平增高顯著(P＜0.05)。
　　6、全腦缺血再灌注導致海馬及皮質(zhì)內(nèi)HIF-1α、PDK1/PDK1

21、 mRNA表達增高，而再灌注階段高濃度氧暴露能夠抑制HIF-1α、PDK1/PDK1 mRNA的高表達:再灌注2小時，NO組HIF-1α、PDK1/PDK1 mRNA表達較對照組明顯增高（P＜0.05）;HO組HIF-1α、PDK1/PDK1 mRNA表達較對照組增高不明顯(P＞0.05); DHO組HIF-1αt、PDK1/PDK1 mRNA表達同樣與對照組比較增高不顯著(P＞0.05);NO組與HO及DHO組比較HIF-1α、PDK

22、1/PDK1 mRNA表達增高(P＜0.05);四組HIF-1α mRNA表達均無顯著差異（P＞0.05）。
　　7、形態(tài)學檢測:再灌注7天透射電鏡下DHO組海馬CA1區(qū)也有更好的亞細胞器（細胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）完整性;而尼氏染色DHO組也較NO、HO組海馬CA1區(qū)也有更好的神經(jīng)元排列及尼氏小體表達。
　　結(jié)論:
　　1、全腦缺血再灌注早期海馬CA1區(qū)發(fā)生爆發(fā)性的羥自由基(·HO)生成，其峰值出現(xiàn)在再灌注的10-20

23、min，而顯著升高的時間段為50min以內(nèi);常壓高濃度氧暴露（純氧）可以顯著地增加·HO生成的強度，表現(xiàn)為其峰值明顯增高且持續(xù)時間顯著延長達到70min;當給予延遲的常壓高濃度供氧（再灌注60min以后給予純氧暴露），其對再灌注·HO的生成較常壓常氧干預無明顯差異。得出結(jié)論:全腦缺血再灌注后ROS的爆發(fā)性生成是一對時間及氧暴露濃度雙重依賴的病理生理學過程。
　　2、全腦缺血再灌注階段不同的氧暴露方式均對腦組織抗氧化系統(tǒng)(SOD、C

24、AT)造成顯著抑制;同時其脂質(zhì)過氧化損傷也有顯著增強，這一特征在給予高濃度氧暴露時更為明顯，但延遲常壓純氧暴露與常壓常氧比較并未見有額外加重的脂質(zhì)過氧化損傷。
　　3、延遲常壓高高氧干預可以改善再灌注階段PDH的活性，有利于恢復和促進腦組織的有氧能量代謝，其機制可能但不完全為:①不進一步加重PDH的過氧化損傷;②改善再灌注階段組織細胞內(nèi)乏氧環(huán)境，通過增加HIF-1α胞漿內(nèi)分解，進而降低其下游PDK1的表達，導致PDHA1-S232