海馬雌激素受體基因表達(dá)與腦老化及學(xué)習(xí)記憶功能關(guān)系的研究.pdf

1、本研究從受體水平探討雌激素受體基因表達(dá)與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)選用快速老化模型小鼠，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timequantitativeRT-PCR)及原位雜交組織化學(xué)(ISHH)的方法，觀察其增齡過程中，雌激素受體兩種亞型在與學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能關(guān)系密切的海馬和視上核腦區(qū)的表達(dá)分布和動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)對(duì)LACA小鼠去卵巢和去睪丸后，給予雌二醇和丙酸睪丸酮替代治療，觀察雌激素受體兩種亞型的變化，此外，還對(duì)LACA小鼠進(jìn)行行

2、為學(xué)實(shí)驗(yàn)(穿梭箱實(shí)驗(yàn)，shuttleboxtest)后，觀察其記憶獲得過程中雌激素受體兩種亞型的變化。目的是闡明在衰老過程中，中樞雌激素受體亞型基因表達(dá)的變化與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系。 一、增齡過程中快速老化模型小鼠海馬雌激素受體亞型的變化快速老化模型小鼠(SAM)是一種出生后隨增齡而發(fā)生的進(jìn)行性快速老化模型小鼠。SAMP8是SAM的亞系之一，具有類似于AD的某些特征，其突出的表現(xiàn)是在增齡過程中，中樞學(xué)習(xí)記憶功能明顯衰退。SAMR1為抗

3、快速老化亞系，其各項(xiàng)生理指標(biāo)及生存期限與正常動(dòng)物相似。在研究SAMP8的病理變化過程中，以SAMR1作為對(duì)照。目前關(guān)于SAMP8學(xué)習(xí)記憶功能衰退的機(jī)理尚未了解清楚，迄今為止尚未見有研究SAMP8增齡過程中中樞雌激素受體亞型基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及其與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以不同月齡(3，6，9，12，15)SAMP8和SAMR1為研究對(duì)象，從其海馬腦區(qū)分離出總RNA，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法，對(duì)兩種亞型的雌激素受體(ERalpha

4、，ERbeta)基因進(jìn)行擴(kuò)增、定量，觀察了在增齡過程中，SAMP8和SAMR1海馬雌激素受體兩種亞型的動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)比較了性別、亞系等因素對(duì)兩種雌激素受體亞型基因表達(dá)的影響。 二、學(xué)習(xí)記憶行為對(duì)海馬雌激素受體基因表達(dá)水平的影響LACA小鼠稱重后，雌雄各分為三組，首先分別進(jìn)行自主活動(dòng)測(cè)試，休息一天后進(jìn)行穿梭箱實(shí)驗(yàn)，從中篩選出條件性回避反應(yīng)率(conditionalavoidanceresponse，CAR)分別為20％，50％和9

5、0％的動(dòng)物，觀察其血清雌二醇(E2)和睪酮(T)水平，并對(duì)其進(jìn)行海馬雌激素受體基因表達(dá)的分析，比較動(dòng)物在學(xué)習(xí)記憶獲得過程中，海馬雌激素受體的變化。雌性在處死動(dòng)物之前，先進(jìn)行陰道涂片檢查，以確保動(dòng)物均在動(dòng)情間期進(jìn)行雌激素受體基因表達(dá)的分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雌鼠和雄鼠隨CAR的增加，血清E2水平均隨之升高。雌鼠的血清T水平有升高趨勢(shì)，雄鼠的血清T水平呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。ERalpha和ERbeta基因表達(dá)從總體看，二者的變化趨勢(shì)

6、是相反的；各組內(nèi)ERbeta基因mRNA表達(dá)水平均明顯高于ERalpha；ERalpha基因mRNA表達(dá)水平無性別之間的差異，雌性ERbeta基因mRNA表達(dá)水平均明顯高于雄性。提示ERalpha和ERbeta基因均參與了整個(gè)記憶獲得過程，在表達(dá)量上ERbeta基因占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，說明ERbeta基因表達(dá)與學(xué)習(xí)記憶的獲得關(guān)系更為密切。 三、17β-雌二醇(17β-E2)和丙酸睪丸酮對(duì)卵巢切除小鼠中樞雌激素受體亞型基因表達(dá)的影響LAC

7、A雌性小鼠，體重24±2g，分為正常對(duì)照組(CON)、假手術(shù)組(Sham)、去卵巢組(OVX)、去卵巢+生理劑量17-β雌二醇(2.4/mouse)組、去卵巢+2倍生理劑量17-β雌二醇(4.8/mouse)組和去卵巢+生理劑量丙酸睪丸酮(6.25mg/kg)組，給藥四周。正常對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)前，先進(jìn)行陰道涂片檢查，以確保動(dòng)物在動(dòng)情間期進(jìn)行雌激素受體基因表達(dá)的分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Sham組相比，OVX組血清E2水平顯著降低(P＜

8、0.05)。去卵巢小鼠給予雌激素和丙酸睪丸酮替代后，血清E2水平顯著升高(P＜0.05)。與假手術(shù)組相比，OVX組血清T水平無變化，給予丙酸睪丸酮替代后，血清T水平顯著升高(P＜0.05)。 OVX組與假手術(shù)組相比，海馬ERalpha基因mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01)，海馬ERbeta基因mRNA的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)。給以不同劑量E2替代后，海馬ERalpha基因mRNA的表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.0

9、1)；ERbeta基因mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01)。丙酸睪丸酮替代組小鼠ERalpha和ERbeta基因mRNA的表達(dá)水平均無明顯變化。比較各組內(nèi)ERalpha和ERbeta基因表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，各組內(nèi)ERbeta基因mRNA的表達(dá)水平均明顯高于ERalpha。 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，去卵巢后血清雌激素水平降低，中樞ERalpha表達(dá)水平升高，ERbeta表達(dá)水平降低，給以雌二醇替代后，血清雌二醇水平增加，中樞ERalpha

10、表達(dá)水平降低，ERbeta表達(dá)水平升高，并且無明顯的量效關(guān)系。給以丙酸睪丸酮替代后，ERalpha和ERbeta基因表達(dá)水平均無明顯變化，說明在雌性動(dòng)物中，血清雌二醇水平可抑制中樞ERalpha基因mRNA的表達(dá)，促進(jìn)ERbeta基因mRNA的表達(dá)，在海馬ERbeta基因mRNA的表達(dá)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。 四、17β-雌二醇(17β-E2)和丙酸睪丸酮對(duì)睪丸切除小鼠中樞雌激素受體亞型基因表達(dá)的影響LACA雄性小鼠，體重24±2g，分為正

11、常對(duì)照組(CON)、假手術(shù)組(Sham)、去睪丸組(ORX)、去睪丸+生理劑量丙酸睪丸酮(6.25mg/kg)組、去睪丸+2倍生理劑量丙酸睪丸酮(13.0mg/kg)組和去睪丸+生理劑量17-β雌二醇(2.4/mouse)組，給藥四周。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，去睪丸后血清睪酮和雌激素水平降低，中樞ERalpha表達(dá)水平升高，ERbeta表達(dá)水平降低。給予丙酸睪丸酮和雌二醇替代后，血清雌二醇水平增加，中樞ERalpha表達(dá)水平降低，ERbet

12、a表達(dá)水平升高。說明在雄性動(dòng)物中，血清雌二醇水平也可抑制中樞ERalpha基因mRNA的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)ERbeta基因mRNA的表達(dá)，在海馬ERbeta基因mRNA的表達(dá)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。 五、快速老化模型小鼠視上核雌激素受體亞型的動(dòng)態(tài)變化視上核位于下丘腦前部外側(cè)區(qū)，幾乎全部由大細(xì)胞神經(jīng)元組成，此類神經(jīng)元可合成垂體后葉素(oxytocin，OT)和血管加壓素(vasopressin，VP)，參與調(diào)節(jié)平滑肌收縮或松弛；促使腎臟對(duì)水及鈉的

13、重吸收。視上核神經(jīng)元內(nèi)嚴(yán)重的神經(jīng)元纖維改變是AD相關(guān)的神經(jīng)元內(nèi)病理改變的一個(gè)顯著標(biāo)志，在衰老和AD發(fā)病過程中視上核神經(jīng)元被激活，即VP神經(jīng)元合成肽的能力被激活。研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)雌激素對(duì)上述視上核大細(xì)胞神經(jīng)元的電生理特性和生物合成活性具有重要的影響。然而，衰老過程中，雌激素是否通過其受體對(duì)該類神經(jīng)元發(fā)揮作用一直是本研究領(lǐng)域中的空白。本研究應(yīng)用原位雜交的方法，觀察不同月齡雌性SAM視上核神經(jīng)元雌激素受體亞型的動(dòng)態(tài)變化，從受體水平上探討腦老化過

14、程中雌激素調(diào)節(jié)視上核神經(jīng)元的機(jī)制。 研究表明，在衰老過程中，視上核神經(jīng)元ERalpha基因轉(zhuǎn)錄水平穩(wěn)定，不隨衰老過程而變化。ERbeta基因表達(dá)呈現(xiàn)明顯的降低趨勢(shì)，說明在增齡過程中ERbeta基因表達(dá)對(duì)調(diào)節(jié)視上核功能方面發(fā)揮作用較大，與衰老過程中視上核功能的改變關(guān)系密切。 六、結(jié)語本研究結(jié)果表明，SAMP8在增齡過程中學(xué)習(xí)記憶功能的進(jìn)行性衰退與中樞雌激素受體基因和胰島素退化酶基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化有關(guān)，在SAMP8與SAMR1

15、增齡過程中，海馬ERalpha基因表達(dá)穩(wěn)定，不隨增齡而變化，無亞系差異，同一亞系亦無性別差異。而ERbeta基因表達(dá)水平隨增齡均發(fā)生不同程度的降低趨勢(shì)，該趨勢(shì)在SAMP8亞系出現(xiàn)較早，在SAMR1亞系出現(xiàn)較晚，同一亞系雌雄之間ERbeta基因表達(dá)變化趨勢(shì)其本一致，但整個(gè)增齡過程，雌性ERbeta基因表達(dá)明顯高于雄性。IDE基因表達(dá)變化趨勢(shì)在增齡過程和亞系與ERbeta相似，但是雌雄之間無顯著差異。雌性SAMP8和SAMR1視上核ERal

16、pha、ERbeta基因表達(dá)的變化趨勢(shì)與海馬基本一致。正常小鼠條件性主動(dòng)回避反應(yīng)能力的獲得與雌激素、睪酮水平及雌激素受體基因的表達(dá)也存在一定的關(guān)系，隨記憶獲得的增加，雌激素、睪酮水平增加，ERalpha基因表達(dá)水平逐漸降低，ERbeta基因表達(dá)水平逐漸增加，整個(gè)過程ERbeta基因表達(dá)明顯高于ERalpha。去卵巢和去睪丸小鼠血清雌激素和睪酮水平顯著降低，海馬ERalpha基因表達(dá)水平明顯升高，ERbeta基因表達(dá)水平明顯降低，給以雌二