補氣收澀法干預腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的作用與機制研究.pdf

1、目的:補氣收澀類中藥是治療腫瘤的常用藥物，其治療作用與抑制腫瘤細胞增殖轉(zhuǎn)移以及調(diào)節(jié)腫瘤血管的生成有關(guān)。補氣收澀法是基于“腫瘤休眠療法”等理念的一種中醫(yī)腫瘤治法，通過固護正氣、收攝癌毒，從而抑制腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移，延長腫瘤患者的生命周期，提高患者的生存質(zhì)量。本課題選擇臨床常用的中藥黃芪和仙鶴草作為研究的對象，通過體外細胞實驗研究補氣收澀藥對人肝癌細胞HepG2和人氣靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)的增殖能力、遷移能力及凋亡的影響，之后進一步檢

2、測促血管生成因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達的情況，初步探究補氣收澀藥配伍對腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移的影響及可能的作用機制，為后續(xù)研究及臨床治療用藥的選擇提供參考。
　　方法:建立肝癌細胞和血管內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)的細胞模型，采用血清藥理學方法，制備補氣收澀藥的含藥血清。用MTT比色法檢測補氣收澀藥含藥血清對HepG2細胞和HUVEC增殖能力的影響，然后采用細胞侵襲實驗檢測其含藥血清對HepG2細胞和HUVEC的侵襲及遷移能力的影響，用Weste

3、rn Blot和Realtime-PCR技術(shù)檢測各給藥組細胞的VEGF、MMP-2和TIMP-2等重要因子的蛋白和基因表達的情況。
　　結(jié)果:細胞實驗的結(jié)果顯示:課題所研究的補氣收澀藥對的含藥血清對肝癌細胞和人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的增殖能力和遷移能力都有較為顯著的影響，與空白血清組相比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　應用Transwell法檢測各組HUVEC細胞的侵襲遷移能力，各實驗組藥物作用48h

4、后，實驗結(jié)果顯示:不同用藥組作用于HUVEC后，正置熒光顯微鏡下觀察Transwell小室下層，透膜的細胞數(shù)目隨著藥物濃度的增加而減少，與空白血清對照組比較具有明顯的差異，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），且細胞形態(tài)也由梭形逐漸變?yōu)閳A形。表明各藥物組明顯降低了HUVEC的侵襲力，并呈一定的劑量依賴性。
　　應用Transwell法檢測各組HepG2細胞的侵襲遷移能力，實驗結(jié)果顯示:各實驗組藥物作用48h后，正置熒光

5、顯微鏡下觀察Transwell小室下層，各實驗組透膜的細胞數(shù)目相比較于空白血清對照組明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），且細胞形態(tài)也由梭形逐漸變?yōu)閳A形。表明各藥物組明顯降低了HepG2細胞的侵襲能力，并呈一定的劑量依賴性。
　　應用Western Blot技術(shù)檢測各組HepG2細胞的VEGF、MMP-2、TIMP-2的蛋白表達狀況，實驗結(jié)果顯示:各實驗組細胞VEGF、MMP-2的蛋白表達減少，與空白血清組比

6、較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，各實驗組細胞TIMP-2的蛋白表達增多，與空白血清組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　用Realtime-PCR技術(shù)檢測各組HepG2細胞的MMP-2、TIMP-2的mRNA表達狀況，實驗結(jié)果顯示:各實驗組細胞MMP-2的mRNA表達減少，與空白血清組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，各實驗組細胞TIMP-2的mRNA表達增多，

7、與空白血清組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　應用Western Blot技術(shù)檢測各組HUVEC細胞的VEGF、MMP-2、TIMP-2的蛋白表達狀況，實驗結(jié)果顯示:各實驗組細胞VEGF、MMP-2的蛋白表達減少，與空白血清組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，各實驗組細胞TIMP-2的蛋白表達增多，與空白血清組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　用R

8、ealtime-PCR技術(shù)檢測各組HUVEC細胞的VEGF的mRNA表達狀況，實驗結(jié)果顯示:各實驗組細胞VEGF的mRNA表達減少，與空白血清組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　結(jié)論:初步的體外細胞實驗可以證實補氣收澀藥對人肝癌細胞HepG2的增殖能力和遷移能力具有明顯的抑制作用，這可能是這些藥物在細胞層面上抑制腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移的作用機制;補氣收澀藥降低了人肝癌細胞HepG2的MMP-2、TIMP-2、V

9、EGF等因子的蛋白及mRNA的表達水平，這可能是這些藥物在分子生物學層面上抑制腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移的作用機制。
　　另外，補氣收澀藥對HUVEC細胞的增殖能力和遷移能力具有明顯的抑制作用，這可能是這些藥物在細胞層面上抑制血管生成的作用機制;另外，補氣收澀藥降低了血管內(nèi)皮細胞的VEGF等因子的蛋白及mRNA的表達水平，這可能是這些藥物在分子生物學層面上抑制腫瘤血管生成的作用機制。
　　綜上所述，體外實驗初步表明，補氣收澀法對腫瘤的增