瘤內(nèi)注射型卡鉑-PLGA緩釋微球體內(nèi)外釋藥及療效機制實驗研究.pdf

1、背景 藥物制成微球后因其對特定器官和組織的靶向性及微粒中藥物釋放的緩釋性，已經(jīng)成為近年來緩控釋劑研究的熱點。卡鉑是第二代鉑類廣譜抗癌藥，將藥物制成微球后順應(yīng)了抗腫瘤制劑長效、高效、低毒的發(fā)展方向，課題組在前期實驗中對卡鉑緩釋微球優(yōu)化制備工藝及其對移植性肝腫瘤和胰腺腫瘤的治療效果、適宜劑量已作初步研究獲得了較好的結(jié)果。微球體外釋放研究能夠較好反映微球在體內(nèi)的釋藥狀況，適宜的體外釋放度實驗對制劑的安全性與有效性是非常重要的。目前體外

2、釋放度測定一般是模仿制劑在體內(nèi)的運轉(zhuǎn)狀況進行的。通常在溫度、攪拌、介質(zhì)、PH值和酶等方面加以模擬。本研究將探討卡鉑緩釋微球體外釋放機制從而了解藥物體內(nèi)釋放的相關(guān)性。 細(xì)胞凋亡是基因或其他一些因素調(diào)控的活組織細(xì)胞自我消亡的過程，這一過程的紊亂直接影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。細(xì)胞凋亡調(diào)控基因可分別抑制和促進細(xì)胞凋亡，其中Bcl-2是凋亡的抑制基因，可以阻斷細(xì)胞凋亡，Bax可與Bcl-2蛋白形成異源二聚體，具有抑制Bcl-2功能，促進細(xì)胞凋

3、亡的作用?？ㄣK微球瘤內(nèi)注射治療大鼠皮下移植瘤微球能否起到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用?微球比原藥療效好，會不會是其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力較原藥強呢? 目的 通過掃描電鏡觀察卡鉑微球體外釋放的超微結(jié)構(gòu)變化了解其藥物控制釋藥機理，從而更好的反映微球在體內(nèi)的釋藥狀況。從細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax來探討卡鉑微球是否具有誘導(dǎo)大鼠皮下移植瘤細(xì)胞凋亡的作用機制，并進一步證明卡鉑微球優(yōu)于卡鉑原藥，從而為化療藥緩釋微球瘤內(nèi)注射治療腫瘤

4、應(yīng)用于臨床奠定基礎(chǔ)。 方法 1．卡鉑-PLGA緩釋微球體外降解機制探討通過掃描電鏡觀察微球體外釋放不同時間點(3、7、14、21d)超微結(jié)構(gòu)變化了解其藥物控制釋藥機理。 2．大鼠Walker-256皮下移植瘤模型的建立采用Walker-256腫瘤細(xì)胞株體外培養(yǎng)傳代，腹水接種法建立大鼠皮下移植瘤模型；超聲動態(tài)觀測腫瘤大小、二維聲像圖和彩色多普勒變化，計算腫瘤體積，描繪腫瘤自然生長曲線。 3．超聲引導(dǎo)瘤內(nèi)注射

5、卡鉑微球治療大鼠皮下移植瘤的療效觀察將荷瘤大鼠分為微球組、卡鉑組、鹽水組和空白對照組，以相應(yīng)藥物劑量進行超聲引導(dǎo)瘤內(nèi)注射治療。超聲動態(tài)監(jiān)測腫瘤二維聲像圖和彩色多普勒變化，計算腫瘤體積和瘤體倍增時間，描繪各組治療中腫瘤生長曲線；觀察腫瘤病理改變特征。 4．卡鉑微球誘導(dǎo)大鼠皮下移植瘤細(xì)胞凋亡及對凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達的影響本研究應(yīng)用免疫組化及細(xì)胞凋亡原位檢測技術(shù)(TUNEL法)檢測腫瘤組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Ba

6、x在卡鉑微球治療大鼠皮下移植腫瘤中的表達。 結(jié)果 1．體外釋放研究結(jié)果顯示卡鉑PLGA微球在初期釋放無突釋效應(yīng)，第1天后緩慢釋放，第2～12天之間微球幾乎以恒定的速度釋放藥物，第13天加速釋放，第14天釋放釋放減慢趨于穩(wěn)定，曲線平穩(wěn)。 卡鉑緩釋微球成品在掃描電鏡下光滑圓整無孔洞。PH7.4磷酸緩沖液為介質(zhì)將微球放入其中，第7天微球表面有褶皺及孔洞出現(xiàn)。第14天微球表現(xiàn)皺縮，孔洞明顯增加。第21天微球皺縮及孔洞范圍

7、更加廣泛。因此，緩釋液中微球隨降解時間延長微球表面皺縮及孔洞也隨之增加。 2．Walker-256腫瘤腹水于SD大鼠右后腿內(nèi)側(cè)皮下接種能成功建立大鼠皮下移植瘤模型。該模型制作簡單、價廉、腫瘤生長穩(wěn)定、自然生存期達50d以上。腫瘤接種后第30天以內(nèi)大鼠不出現(xiàn)皮膚破漬和腹水，腫瘤聲像圖表現(xiàn)為邊界清晰的單一低回聲結(jié)節(jié)、彩色血流信號豐富；接種后第7天腫瘤最大徑為11.59±1.28mm。 3．對比各組大鼠的腫瘤體積、生長曲線和瘤

8、體倍增時間，第21天的觀察期內(nèi)微球組腫瘤生長持續(xù)受到抑制，卡鉑組僅在給藥后的前7天為明顯的抑制作用，以后逐漸消失；而微球組在各時間段表現(xiàn)為持續(xù)的腫瘤抑制作用，前3天微球組抑制作用略弱于卡鉑組，后4天抑制作用略強于卡鉑組但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。第7～14天及14～21天微球組對腫瘤抑制作用持續(xù)存在，強于卡鉑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，此時卡鉑組與對照組和鹽水組相比抑制作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明微球?qū)δ[瘤的抑制作用持久，能提高療效。聲像圖顯示各治療組

9、腫瘤內(nèi)部血流明顯減少，微球組治療后腫瘤內(nèi)部呈不均質(zhì)高回聲，部分腫瘤后期出現(xiàn)液化壞死；卡鉑組及對照組回聲變化不明顯。腫瘤病理觀察可見，各治療組腫瘤內(nèi)均可見大片凝固性壞死區(qū)。 4．通過TUNEL法檢測，微球組隨各時間點的增加凋亡指數(shù)也跟隨著各時間點的變化明顯升高，而卡鉑組隨時間點的增加凋亡指數(shù)則明顯減低。微球組的大鼠腫瘤組織中的BcL-2基因蛋白表達明顯低于其他各組，而Bax基因蛋白表達明顯高于其他各組，其腫瘤細(xì)胞的AI明顯高于其他

10、各組。 結(jié)論 1．卡鉑-PLGA緩釋微球具有一定的緩控能力。其包封的卡鉑藥物晶體是通過“孔洞”溶滲作用逐漸釋放出微球的。 2．SD大鼠右后腿內(nèi)側(cè)皮下接種Walker-256腫瘤成功率高，符合瘤內(nèi)注射藥物治療研究的大鼠實體腫瘤模型。SD大鼠生長穩(wěn)定、自然生存期長。 3．超聲引導(dǎo)瘤內(nèi)注射卡鉑微球治療大鼠皮下移植瘤較卡鉑原藥組具有更明顯的抑瘤效果；本實驗結(jié)果表明，此治療方法簡便易行、效果顯著，有望成為實體腫瘤治