重組多肽Tat-HA-NR2B9C載體構(gòu)建、表達與分離純化.pdf

1、腦卒中是危害人類生命與健康的常見病、多發(fā)病，具有較高的致殘率和死亡率。迄今，在臨床上除早期使用溶栓藥對腦缺血有效外，尚缺乏療效明確的治療藥物。 通過對腦缺血模型的病理研究發(fā)現(xiàn)，NMDA(N-methyl-D-aspartate)受體過度激活導(dǎo)致腦損傷。興奮性毒性假說認為，NMDA受體過度激活，引起大量的Ca<'2+>內(nèi)流，是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和死亡的主要原因。因此，大量的臨床前理論研究認為NMDA受體拮抗劑可以治療缺血性腦損傷。但是

2、，近十年來NMDA受體拮抗劑的臨床研究的結(jié)果表明，所有臨床研究使用的NMDA受體拮抗劑均因療效不確切或嚴重不良反應(yīng)而被停用。有研究者認為，NMDA受體拮抗劑阻斷NMDA受體興奮性毒性作用的同時也阻斷了NMDA受體的正常生理功能。因此，對于突觸后信號通路的研究為阻斷NMDA受體過度激活引起的興奮性毒陛找到了新的途徑。 PSD-95(postsynaptic density-95)是一種重要的調(diào)節(jié)蛋白，它將NMDA受體信號傳遞給細胞

3、內(nèi)蛋白和酶。PSD-95通過第二個PDZ結(jié)構(gòu)域與NR2B羧基端的tSXV基序結(jié)合，同時也可以與nNOS(neuronal nitric oxide synthase)結(jié)合，激活nNOS。研究發(fā)現(xiàn)PSD-95介導(dǎo)了NMDA受體的過度激活所導(dǎo)致的NO(nitric oxide)釋放，從而引起神經(jīng)興奮毒性。本實驗室的研究還發(fā)現(xiàn)，NMDAR/PSD-95/nNOS偶聯(lián)通路對神經(jīng)元再生起抑制作用。因此阻斷該通路的信號傳導(dǎo)可能有利于減輕缺血性損傷，

4、促進腦卒中后神經(jīng)元的再生，從而改善腦缺血誘導(dǎo)的記憶功能損傷。Tat能夠攜帶有功能的NRB9C多肽片斷進入細胞內(nèi)并有效的干攏NMDA受體和PSD-95的結(jié)合，阻斷引起神經(jīng)毒性的下游信號，但不影響神經(jīng)突觸的活性和生理狀態(tài)TCa<'2+>的內(nèi)流。動物實驗表明，Tat-NR289C能夠降低大鼠缺血后腦損傷的面積并能夠促進神經(jīng)功能的恢復(fù)。因此，Tat-MR2B9C多肽有可能成為一種用于治療腦卒中的可行方法，同時為開發(fā)新的有臨床應(yīng)用價值的新藥提供實

5、驗基礎(chǔ)。 本論文研究的目的是原核表達Tat蛋白的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Protein Transduction Domain，PTD)與NR289C的融合多肽片段，并在兩片段中插入血凝素(hemagglutinin，HA)的附加抗原表位(epitope tag)。根據(jù)Tat、HA及NMDA受體羧基端9個氨基酸的氨基酸序列，在計算機輔助下設(shè)計出Tat-HA-NR289C多肽基因的全序列。根據(jù)該序列設(shè)計出4條寡核苷酸引物片斷。以pED質(zhì)粒

6、為模版，同過三次加尾PCR將原pED質(zhì)粒的L-ansB-C基因加尾合成Ans-Tat-HA-NR289C。將該基因克隆到pET-28a的限制性內(nèi)切酶位點上，并預(yù)留酸水解位點(aspartyl-prolyl linker)，構(gòu)建表達載體pED-Tat-HA-NR289C，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)。經(jīng)乳糖誘導(dǎo)后，融合蛋白表達量只有全菌體蛋白的5％左右，通過對培養(yǎng)基、誘導(dǎo)時間的優(yōu)化，確定含0.1％精氨酸

7、的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)4小時后加入乳糖至終濃度5mM，誘導(dǎo)4小時后，融合蛋白表達量可以提高到全菌體蛋白的30％左右。該培養(yǎng)基命名為精氨酸富集培養(yǎng)基，用于提高Tat融合蛋白的表達量并且不影響菌體的生長。融合蛋白的大量表達形成包涵體，包涵體在4M尿素裂解下，釋放融合蛋白ansB-C-Tat-HA-NR289C，并在2倍乙醇條件下被沉淀。在80mmol/L，HCl，50℃水解72h，融合蛋白ansB-C-Tat-HA-NR289C水解出目的多肽Ta

8、t-HA-NR289C。由于目的多肽等電點在10.4左右，經(jīng)陽離子交換柱層析，在高鹽離子濃度下洗脫目的蛋白。本論文成功構(gòu)建了Tat-HA-NR289C與天冬酰胺酶C端的融合表達載體(pED-Tat-HA-NR289C)，并表達純化了目的蛋白Tat-HA-NR289C。通過此過程建立了一套簡單可行的融合蛋白表達、水解、分離與純化的方法。通過該方法可以獲得一定量的Tat-HA-NR289C多肽，用于研究其促進神經(jīng)元再生(神經(jīng)元增殖、分化、存