牡蠣鋅離子結(jié)合活性肽的分離純化及其促鋅吸收效果研究.pdf

1、鋅作為重要的礦質(zhì)元素之一對(duì)于維持人體的新陳代謝必不可少，但缺鋅癥狀較為常見。目前市場(chǎng)上存在許多補(bǔ)鋅產(chǎn)品，其安全性和生物利用率并不高。許多研究證明了肽具有促進(jìn)礦質(zhì)元素吸收的能力，作為新型的礦質(zhì)離子補(bǔ)充劑，肽-鋅復(fù)合物的構(gòu)效關(guān)系及其作用機(jī)理尚不明確，限制了對(duì)其進(jìn)行研究與開發(fā)利用。因此，本研究以太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）為原料，采用生物酶解技術(shù)制備鋅離子結(jié)合活性肽，并對(duì)其進(jìn)行分離純化，解析其結(jié)構(gòu)特征，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討

2、肽-鋅復(fù)合物的補(bǔ)鋅效果，闡述其生物利用的可能機(jī)理。研究內(nèi)容主要包括：
　　1.牡蠣鋅離子結(jié)合活性肽的酶解與反應(yīng)條件優(yōu)化。以鋅離子結(jié)合能力和蛋白回收率為指標(biāo)，對(duì)六種商業(yè)蛋白酶及其復(fù)合酶酶解方式進(jìn)行篩選優(yōu)化，確定胃蛋白酶為最佳水解酶；在此基礎(chǔ)上對(duì)胃蛋白酶酶解過程中的水解度和鋅離子結(jié)合能力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)水解時(shí)間為150 min時(shí)，水解度和鋅離子結(jié)合能力均達(dá)到最大值，分別為24.44％和5.36μg/mg；采用單因素實(shí)驗(yàn)的方法，對(duì)牡蠣酶

3、解物與鋅鹽反應(yīng)過程中的pH，多肽蛋白（配體）濃度，蛋白與鋅鹽的質(zhì)量比，反應(yīng)的溫度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行分析，得出多肽與鋅鹽反應(yīng)的最適條件為：pH6.5，肽濃度4%，肽與鋅鹽的質(zhì)量比3:1，反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時(shí)間30min；通過測(cè)定胃蛋白酶酶解液中不同組分含量和鋅離子結(jié)合活性證實(shí)了<5kDa組分占優(yōu)勢(shì)，其含量為88.11%，鋅離子結(jié)合能力為5.21-5.30μg/mg。
　　2.牡蠣鋅離子結(jié)合活性肽的分離純化與結(jié)構(gòu)解析。通過固定化金屬親和

4、層析（IMAC-Zn2+）篩選出酶解物中鋅離子結(jié)合能力強(qiáng)的組分F3，后用反相高效液相色譜（RP-HPLC）將該組分作進(jìn)一步分離并用液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS）鑒定出目的組分（F32）序列為HLRQEEKEEVTVGSLK（從N端到C端），分子量為1882.0Da，經(jīng)測(cè)定F32的鋅離子結(jié)合能力為6.56μg/mg，顯著高于粗酶解液（P<0.05）；體外模擬胃腸道消化實(shí)驗(yàn)顯示該序列的活性能夠絕大部分的保留，約為原始的85.98%；紫外和紅外

5、光譜中發(fā)現(xiàn)了鋅離子結(jié)合前后肽譜圖中出現(xiàn)了特征吸收峰的消失、減弱和遷移，這些均證實(shí)了多肽中的氨基氮原子和羧基中的氧原子是鋅離子結(jié)合的主要位點(diǎn)。
　　3.牡蠣鋅離子結(jié)合活性肽的補(bǔ)鋅效果研究。對(duì)缺鋅大鼠補(bǔ)充不同形式的鋅鹽，觀察其生長狀況，發(fā)現(xiàn)缺鋅組大鼠4周的體重增重率僅為17.3%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于補(bǔ)鋅組，而牡蠣肽-鋅復(fù)合物和CPP-鋅復(fù)合物組的效果優(yōu)于無機(jī)鋅組，說明缺鋅會(huì)影響大鼠的生長；不同組織和器官中的鋅含量同樣顯示牡蠣肽-鋅復(fù)合物組和CP