銀杏提取物對重癥急性胰腺炎大鼠肝組織NF-kB活化及肝細(xì)胞凋亡作用的實(shí)驗研究.pdf

1、研究背景： 重癥急性胰腺炎(severeacutepancreatitis，SAP)是一種常見的臨床急腹癥。目前其發(fā)病機(jī)制仍未被完全闡明。此病臨床病情兇險、并發(fā)癥多、死亡率高，早期死亡的主要原因是多器官衰竭，肝臟是最早最常受累的胰外器官，肝損害的程度與胰腺炎的程度成正相關(guān)。肝損害的機(jī)制非常復(fù)雜，是目前臨床和科研工作中的倍受關(guān)注的熱點(diǎn)問題。研究表明重癥急性胰腺炎合并肝損害的機(jī)制主要與炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、血管活性物質(zhì)、氧自由基、NF

2、-κB、細(xì)胞凋亡、胰酶的作用機(jī)制等有關(guān)。 NF-κB作為一種重要的多極性細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控多種與炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，近年來研究證實(shí)它在肝臟損傷、再生、凋亡等方面均有重要作用，并提示NF-κB活化異常與SAP嚴(yán)重程度相關(guān)。在SAP發(fā)生時，NF-κB的活化導(dǎo)致TNF-a、IL-6等因子的表達(dá)上調(diào)，大量細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)可共同參與并介導(dǎo)肝損傷的發(fā)生。其中TNF-a起著核心的作用，TNF-a主要通過細(xì)胞毒作用、激活炎性細(xì)胞及損傷

3、微循環(huán)導(dǎo)致胰腺及胰外器官損害，TNF-a也有誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的作用。有通過研究SAP大鼠模型發(fā)現(xiàn)，TNF-amRNA在肝組織中的表達(dá)升高，并且其程度與胰腺炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示FNF-a與SAP時的肝臟損害密切相關(guān)，這一過程可能是SAP并發(fā)肝損傷的重要機(jī)制。目前較多的研究表明，SAP發(fā)生時的肝細(xì)胞凋亡可能是導(dǎo)致肝功能衰竭的重要原因之一。 肝臟是機(jī)體的最大腺體，參與體內(nèi)的消化、代謝、排泄、解毒和免疫等功能，多種內(nèi)外源性物質(zhì)都要經(jīng)

4、過肝臟進(jìn)行合成、分解、轉(zhuǎn)化、儲存，因此是最大的代謝器官，病理情況下與機(jī)體內(nèi)環(huán)境相互影響，特別是在重癥急性胰腺炎時，多種致傷因子的聯(lián)合打擊，使肝功能嚴(yán)重受損，甚至危及生命。因此研究肝損傷的機(jī)制，對防治重癥急性胰腺炎具有重大的意義。 隨著對銀杏葉提取物(EGb)研究的深入，發(fā)現(xiàn)其含多種化學(xué)成分，對防治人類多種疾病有許多重要的藥用價值，藥理研究揭示其具有消除自由基、對循環(huán)系統(tǒng)的調(diào)整、改善血流動力學(xué)、組織保護(hù)等作用，但其應(yīng)用于重癥胰腺炎

5、防治作用機(jī)制方面的研究報道不多。因此本實(shí)驗探討重癥胰腺炎肝損傷的機(jī)制及肝細(xì)胞凋亡情況，觀察銀杏葉提取物注射液對肝損傷時NF-κB活化表達(dá)及肝細(xì)胞凋亡作用的影響，為臨床上重癥急性胰腺炎診治提供理論和實(shí)踐依據(jù)。 目的： 探討重癥胰腺炎肝損傷時NF-κB活化表達(dá)及肝細(xì)胞凋亡作用，揭示重癥胰腺炎肝損傷發(fā)生的部分機(jī)制，觀察銀杏葉提取物注射液對肝損傷治療作用。 方法： 雄性Wister大鼠63只，清潔級，體重250-

6、300克。實(shí)驗動物分組：假手術(shù)組15只，SAP組24只，銀杏葉提取物治療組24只。每組再按6h、12h、24h三個時間點(diǎn)分配，假手術(shù)組每個時間點(diǎn)分配5只大鼠，SAP組及治療組每組每個時間點(diǎn)分配8只大鼠。采用2.5％戊巴比妥鈉1ml/kg腹腔注射麻醉，上腹部縱切口切開進(jìn)腹腔，在胰腺尾部被膜下注射5％牛黃膽酸鈉制作SAP動物模型。假手術(shù)組僅翻動胰腺，不給藥物。治療組于制模前一天開始經(jīng)腹腔注射EGb液，每8h一次，劑量15mg/kg。各組在6

7、h、12h、24h三個時間點(diǎn)處死大鼠，心臟穿刺采血全自動生化分析儀測定ALT、AST，放射免疫法測定血清TNF-a。經(jīng)腹部原切口入腹切取肝胰腸等組織標(biāo)本并用10％溶液固定，石蠟包埋，制作石蠟切片。 HE染色光鏡下觀察肝組織病理變化。采用NF-κB亞基P65單抗試劑盒(免疫組化法)測定肝組織NF-κB活化情況，觀察4-5個高倍(10×40)視野，計數(shù)細(xì)胞核陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的百分比。原位末端標(biāo)記法(TUNEL)進(jìn)行肝細(xì)胞凋亡檢測

8、，數(shù)4-5個高倍視野(10×40倍)，分別計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，Al=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100％。 實(shí)驗結(jié)果劑量資料值用X±S顯示，各組均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計資料的方差分析，SAP組與SO組、EGB組組間兩兩比較采用Dunnett法，NF-κB活化表達(dá)和肝細(xì)胞凋亡分析應(yīng)用相關(guān)分析，P＜0.05為差異有顯著意義。統(tǒng)計軟件采用SPSS10.0。 結(jié)果： SAP組ALT、AST明顯升高，且隨時間延長逐漸升高；

9、TNF-α也隨病程時間延長而增高；EGB組ALT、AST和TNF-a下降，但有隨時間增高趨勢。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理顯示SAP組與SO組、EGB組兩兩比較應(yīng)用Dunnett法有顯著性差異(P＜0.05)。 HE切片：SO組未見異常；SAP組6小時肝組織輕度腫脹，鏡下肝細(xì)胞輕度水腫，12小時肝組織炎性細(xì)胞浸潤，24小時細(xì)胞點(diǎn)片性、局灶性壞死，間質(zhì)和匯管區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤；EGB組肝組織病理改變較SAP組減輕。 免疫組化法肝組織NF-

10、κB活化表達(dá)顯示，SAP組表達(dá)明顯增高，EGB組表達(dá)下調(diào)，統(tǒng)計學(xué)處理SAP組與SO組和EGB組兩兩比較用Dunnett法有顯著性差異(P＜0.05)。 TUNEL法進(jìn)行肝細(xì)胞凋亡檢測顯示，SAP組肝細(xì)胞凋亡明顯增多，凋亡指數(shù)升高，EGB組肝細(xì)胞凋亡明顯下降，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理SAP組與SO組和EGB組兩兩比較用Dunnett法有顯著性差異(P＜0.05)。 相關(guān)分析顯示，肝細(xì)胞NF-κB活化表達(dá)、肝細(xì)胞凋亡指數(shù)與TNF-a、肝