基于PEG及聚磷酸酯的刷形嵌段共聚物的合成與應(yīng)用.pdf

1、基因治療對(duì)治療各種基因疾病（包括遺傳性疾病、感染性疾病和癌癥等）具有潛在的療效，有著重要的發(fā)展前景。安全、高效、穩(wěn)定的基因載體是基因治療中的一個(gè)重要方向?；蜉d體的制備和控制釋放涉及材料學(xué)、分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及高分子化學(xué)等領(lǐng)域，具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值，非病毒陽(yáng)離子型基因載體因其具有較高的負(fù)載效率而受到廣泛的關(guān)注。本論文利用親水性刷形聚合物的諸多優(yōu)點(diǎn)，即具有表面防污、屏蔽電荷、降低復(fù)合物的自聚集、降低載體毒性、延長(zhǎng)載體在體內(nèi)的循

2、環(huán)時(shí)間、且使載體具有抗蛋白非特異吸附性能，結(jié)合磁性納米粒子、還原敏感二硫鍵、生物可降解聚磷酸酯、熒光分子香豆素的優(yōu)點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了一系列刷形聚合物，用于構(gòu)建多重響應(yīng)性基因載體。對(duì)刷形聚合物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、合成表征、生物相容性以及作為基因載體的性能進(jìn)行了研究。論文的主要內(nèi)容分為以下幾個(gè)方面:
　　(1)利用聚陽(yáng)離子修飾的磁性納米子、刷形聚陰離子以及DNA，通過(guò)靜電作用，構(gòu)建磁響應(yīng)性復(fù)合基因載體。首先采用氧陰離子引發(fā)聚合，制備含膽固醇的陽(yáng)離

3、子聚合物，即末端含膽固醇的聚[甲基丙烯酸-2-（N,N-二甲氨基）乙酯](Chol-PDMAEMA)，再通過(guò)配體交換法，獲得陽(yáng)離子聚合物修飾的磁性納米粒子，用于縮合DNA;通過(guò)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)和后修飾反應(yīng)，制備含巰基（-SH）的刷形陰離子嵌段共聚物聚（聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸酯）-b-聚甲基丙烯酸（PPEGMA-b-PMAASH），與上述磁性陽(yáng)離子載體作用，形成復(fù)合物載體，在雙氧水或空氣中O2作用下，-SH交聯(lián)成二硫鍵(S

4、-S)，可將包載的DNA固定于聚合物載體中，提高了載體在血液循環(huán)過(guò)程中的穩(wěn)定性，當(dāng)載體到達(dá)細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境中，在細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽作用下，二硫鍵斷裂，釋放出包裹的DNA。利用核磁共振氫譜(1H NMR)和凝膠滲透色譜(GPC)對(duì)聚合物進(jìn)行表征。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、zeta電位、動(dòng)態(tài)激光光散射儀(DLS)、透射電鏡(TEM)、細(xì)胞毒性測(cè)試，抗蛋白吸附測(cè)試以及轉(zhuǎn)染測(cè)試對(duì)載體進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　(2)利用單電子轉(zhuǎn)移活性自由基聚合(SET-LRP)

5、和開(kāi)環(huán)聚合(ROP)法，制備側(cè)鏈接枝生物可降解聚磷酸酯的刷形嵌段共聚物(PHEMA-g-PEEP)-b-PDMAEMA。首先利用兩步SET-LRP反應(yīng)，獲得甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)與甲基丙烯酸-2-（N,N-二甲氨基）乙酯(DMAEMA)的兩嵌段共聚物PHEMA-b-PDMAEMA;再利用嵌段共聚物中PHEMA側(cè)基上的羥基，對(duì)環(huán)狀磷酸酯單體(EEP)進(jìn)行開(kāi)環(huán)接枝聚合，獲得(PHEMA-g-PEEP)-b-PDMAEMA。利用1H N

6、MR、31P NMR、紅外光譜(FT-IR)和GPC對(duì)聚合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。采用熒光探針?lè)y(cè)試聚合物的臨界聚集濃度(CAC)值，并且，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、zeta電位、DLS、TEM、細(xì)胞毒性以及體外轉(zhuǎn)染測(cè)試對(duì)其作為基因載體的性質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
　　(3)結(jié)合開(kāi)環(huán)聚合(ROP)、原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)和點(diǎn)擊化學(xué)(Click)反應(yīng)，制備基于PEG刷形聚合物的熒光/pH響應(yīng)的酸敏感型嵌段共聚物CE-PCL-a-(PDMAEMA-

7、co-PPEGMA)。首先利用熒光分子7-（2'-羥基-3'-氯）丙烷-4-甲基香豆素(CE)的羥基開(kāi)環(huán)單體己內(nèi)酯(ε-CL)，獲得CE-PCL，接著，對(duì)CE-PCL端基的羥基進(jìn)行修飾，使端基成為具有酸敏感縮醛基的縮醛-疊氮基團(tuán);另一方面，利用ATRP法合成端基為炔基的PPEGMA和PDMAEMA的刷形無(wú)規(guī)共聚物。通過(guò)“Click”反應(yīng)，將上述兩個(gè)嵌段共聚物的疊氮基團(tuán)和炔基進(jìn)行反應(yīng)，獲得酸敏感型嵌段共聚物CE-PCL-a-(PDMAEM

8、A-co-PPEGMA)。這種具有熒光性的共聚物在水中可以自組裝形成膠束，可以同時(shí)包載藥物和基因，發(fā)揮協(xié)同作用，用于癌癥治療。利用1H NMR、FT-IR和GPC對(duì)聚合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。通過(guò)熒光探針?lè)y(cè)定聚合物的臨界聚集濃度(CAC)，利用瓊脂糖凝膠電泳、zeta電位、DLS、TEM、細(xì)胞毒性測(cè)試、藥物釋放以及內(nèi)吞、轉(zhuǎn)染測(cè)試等對(duì)所構(gòu)建的載體及載體的熒光性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
　　(4)利用兩步原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)法和后修飾反應(yīng)，

9、制備半乳糖修飾的陽(yáng)離子型刷形共聚物P(PEGMEMA-co-PEGMAGal)-b-PDMAEMA。首先，通過(guò)ATRP法制備單體聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸酯(PEGMEMA)和聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)的無(wú)規(guī)共聚物P(PEGMEMA-co-PEGMA)，再將其作為大分子引發(fā)劑，引發(fā)陽(yáng)離子型單體DMAEMA進(jìn)行ATRP反應(yīng)，獲得三組分兩嵌段的陽(yáng)離子型刷形共聚物P(PEGMEMA-co-PEGMA)-b-PDMAEMA。進(jìn)一步地，利用

10、PPEGMA側(cè)鏈上的羥基鍵合肝靶向分子半乳糖，獲得半乳糖修飾的陽(yáng)離子型刷形嵌段共聚物P(PEGMEMA-co-PEGMAGal)-b-PDMAEMA。通過(guò)1HNMR、FT-IR以及GPC測(cè)試對(duì)聚合物的結(jié)構(gòu)、分子量及分子量分布進(jìn)行表征，通過(guò)凝膠阻滯電泳測(cè)試，研究了陽(yáng)離子型刷形嵌段共聚物結(jié)合DNA的能力，利用zeta電位研究載體的表面電荷、通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)測(cè)試了載體的生物相容性，并且對(duì)比了半乳糖修飾的陽(yáng)離子型刷形嵌段共聚物P(PEGMEMA