重組布氏乳桿菌漆酶表達(dá)的研究.pdf

1、我國(guó)作為農(nóng)業(yè)大國(guó)每年秸稈的產(chǎn)量非常高，但是僅有少量被用于工業(yè)生產(chǎn)，大多數(shù)都被作為廢棄物直接傾入環(huán)境，這樣形成了非常大的污染以及浪費(fèi)秸稈被用于制作青貯飼料是使秸稈“變廢為寶”的有效途徑之一，而秸稈能否被有效利用取決于木質(zhì)素能否有效降解。木質(zhì)素作為青貯飼料的添加劑可以大大提高其利用率，但由于其產(chǎn)量較低無(wú)法滿足工農(nóng)業(yè)需求。據(jù)報(bào)道稱(chēng)漆酶已在多種宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，以求提高其產(chǎn)量。而乳酸菌是食品級(jí)安全微生物，若能作為宿主細(xì)胞異源表達(dá)漆酶，構(gòu)建

2、重組工程乳酸菌作為新型微生物制劑添加于青貯飼料中，將發(fā)揮乳酸菌與漆酶的雙重功能，漆酶是重要的木質(zhì)素降解酶，具有分泌漆酶功能的重組乳酸菌若用于青貯飼料的發(fā)酵，可以大大提高飼料的利用率及飼料的品質(zhì)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　本研究是在將杏鮑菇漆酶基因轉(zhuǎn)入乳酸桿菌中的基礎(chǔ)上，研究該重組乳酸菌是否能表達(dá)漆酶，并且研究該漆酶的相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)和功能，為將具有分泌漆酶功能的乳酸菌添加于青貯飼料中提供基礎(chǔ)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)室將杏鮑菇漆酶基因接入食品級(jí)宿主

3、細(xì)胞乳酸菌中，成功構(gòu)建重組工程乳酸菌。本研究將獲得的乳酸菌工程菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得重組菌分泌的漆酶，研究了該漆酶的酶學(xué)特性。進(jìn)行了如下試驗(yàn):
　　1.為篩選出單個(gè)轉(zhuǎn)化株，將重組工程乳酸菌液涂布到含有紅霉素的固體MRS培養(yǎng)基中，挑取轉(zhuǎn)化子的菌落進(jìn)行PCR，然后篩選陽(yáng)性重組乳酸菌。
　　2.并提取篩選到的陽(yáng)性重組子質(zhì)粒，進(jìn)一步進(jìn)行PCR驗(yàn)證。
　　3.將驗(yàn)證過(guò)確實(shí)存在漆酶基因的陽(yáng)性重組子涂布到含有0.04％愈創(chuàng)木酚的MR

4、S固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，表達(dá)產(chǎn)物用平板顯色法實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，重組乳酸菌若能產(chǎn)生漆酶菌落顏色會(huì)變成紅棕色，表明該重組子具有分泌漆酶的能力，挑取顏色變化較深的菌落，搖瓶培養(yǎng)并用ABTS測(cè)定其表達(dá)的漆酶活性。
　　4.比較重組工程乳酸菌與原載體乳酸菌的產(chǎn)酸性能。
　　成功篩選到具有產(chǎn)漆酶能力的重組工程乳酸菌，對(duì)其適宜溫度、酸堿度進(jìn)行了研究。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:重組工程乳酸菌具有表達(dá)漆酶的能力，但其分泌的漆酶酶活性相對(duì)很低，酶活